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Revisión del 17:19 2 mar 2015

Diagrama del posible mecanismo de los CRISPR.[1]​

Los CRISPRs (en inglés: clustered regularly interspaced short palindromic repeats, o bien, repetidos cortos palindrómicos aglomerados regularmente interespaciados) son locus de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Después de cada repetición hay segmentos cortos de "ADN espaciador" proveniente de exposiciones previas a un virus.[2]​

Los CRISPRs se encuentran en aproximadamente el 40% de los genomas bacterianos secuenciados y el 90% de los genomas de las arqueas secuenciadas. [3]​ [4]​

Los CRISPRs son frecuentemente asociados con los genes cas que codifican para proteínas relacionadas a los CRISPRs. El sistema CRISPR/Cas es un sistema inmune procariótico que confiere resistencia a elementos genéticos externos como plásmidos y fagos [5]​ [6]​ y provee una forma de inmunidad adquirida. Los espaciadores de los CRISPR reconocen y cortan esos elementos génicos exógenos en una manera análoga al ARNi en sistemas eucarióticos.[2]​

Desde el 2013, el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y la regulación génica a lo largo de las especies vivas.[7]​ Al administrar la proteína Cas9 y los RNA guía apropiado a una célula, el genoma del organismo puede ser cortado en cualquier lugar deseado.

Puede ser posible usar a los CRISPRs para construir sistemas de entrega de genes guiados por ARN que sean capaces de alterar los genomas de poblaciones enteras.[8]​

Historia

Las bacterias pueden incorporar DNA externo en otras circunstancias e incluso pueden tomar ADN dañado de su medio.[9]​

Los repetidos fueron descritos por primera vez en 1987 en la bacteria Escherichia coli.[10]​ En el año 2000, repetidos aglomerados similares fueron identificados en otras bacterias y arqueas y fueron nombrados repetidos cortos regularmente espaciados: Short Regularly Spaced Repeats (SRSR).[11]​ Se les cambió el nombre a los SRSR a CRISPR in 2002.[12]​ Fue encontrado que un conjunto de genes, algunos de los cuales codifican nucleasas o helicasas putativas, estaba asociado a los repetidos CRISPR (los genes cas o asociados a CRISPR).[12]​

Diagrama simplificado de un locus CRISPR, se muestran sus tres componentes mayoritarios: los genes cas, una secuencia líder y un arreglo de repetidos-espaciadores. Los repetidos se muestran como cajas grises y los espaciadores son las barras de color. El arreglo de esos tres componentes no siempre es como se muestra. [1]​ [2]​ Además, varios CRISPRs con una con un DR similar pueden presentarse en el mismo genoma, de los cuales sólo uno esté asociado con los genes cas.[4]​

En el 2005, tres grupos de investigación independientes mostraron que algunos de los espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN de fagos y ADN extracromosomal como los plásmidos.[13]​[14]​[15]​ Esas observaciones clave indican que el sistema CRISPR/cas puede tener un rol en la inmunidad adaptativa en bacterias.[1]​ Koonin y sus asociados[16]​ propusieron que los espaciadores sirven como plantilla para moléculas de ARN, análogo a un sistema que usan los eucariontes llamado interferencia por ARN.

En 2007 Barrangou, Horvath (científicos de la industria alimenticia en Danisco) y el grupo de Moineau en la Université Laval (Canadá) mostaron que podían alterar la resistencia de Streptococcus thermophilus a atques de fagos con ADN espaciador.[16]​

Doudna y Charpentier habían estado explorando de manera independiente a las proteínas asociadas a CRISPRpara aprender cómo las bacterias utilizan a los espaciadores en sus sistemas inmunes. Juntos, estudiaron un sistema CRISPR más simple que se basa en una proteína llamada Cas9. Encontraron que las bacterias responden ante un fago invasor al transcribir espaciadores y ADN palindrómico en una larga molécula de ARN y que entonces la célula utilizaba a un ARN llamado Trans-activating crRNA (tracrRNA) y a Cas9 para cortarla en pedazos llamados ARNcr.[16]​

Cas9 es una nucleasa, una enzima especializada en cortar ADN, con dos sitios de corte activos (HNH and RuvC), uno para cada hebra de la doble hélice. El equipo demostró que podrían desactivar uno o ambos sitios preservando la habilidad de Cas9 de ser específico para su ADN objetivo. Jinek combinó al tracrRNA y ARN espaciador para formar una molécula llamada "single-guide RNA" que, al combinarse con Cas9, podía encontrar y cortar los blancos correctos de ADN. Jinek propuso que estos ARN guía sintéticos podrían usarse para la edición de genes.[16]​

La primera vez que se mostró que CRISPR funcionaba como una herramienta de ingeniería de genoma en cultivos de células humanas fue en 2012.[17]​[18]​ Desde entonces se ha utilizado en muchos organismos incluyendo a la levadura del pan (S. cerevisiae),[19]​ pez cebra (D. rerio),[20]​ moscas(D. melanogaster),[21]​ nemátodos (C. elegans),[22]​ plantas,[23]​ ratones,[24]​ entre otros.

Adicionalmente CRISPR ha sido modificada para hacer factores de transcripción programables que permiten a los científicos silenciar o activar ciertos genes.[25]​

Existen ahora librerías con decenas de miles de ARN guía.[16]​

La primera evidencia de que CRISPR puede revertir síntomas de enfermedad en organismos vivos fue demostrada en marzo de 2014, cuando investigadores del MIT curaron a ratones de desórdenes genéticos de hígado. [26]​

Predecesores para edición génica

Al inicio de la década de los 2000, investigadores desarrollaron las nucleasas con dedos de zinc, proteínas sintéticas cuyoas regiones de unión a ADN les permitían cortar el ADN en puntos específicos. Después, las nucleasas sintéticas llamadas TALENs dieron una vía más sencilla para llegar a ADN específico y se predijo que sobrepasarían a los dedos de zinc. Ambas dependen en hacer proteínas específicas para cada ADN objetivo, un procedimiento bastante más complicado que los ARN guía. Los CRISPRs son más eficientes y pueden llegar a más genes que ambas técnicas.[27]​

Estrucura del locus

Repetidos y espaciadores

Los locus de CRISPR van de 24 a 48 pares de bases.[28]​ Usualmente muestran algún grado de estructura palindrómica implicando la formación de una estructura secundaria de ácidos nucleicos como los stem-loop y los hairpin, pero no son palindrómicas del todo.[29]​ Los repetidos están separados pr espaciadores de longitud similar.[28]​ Algunas secuencias espaciadoras de CRISPR son complemetarias a aquellas de los plásmidos y fagos,[13]​[14]​[15]​ aunque algunos espaciadores se complementan con el genoma procarionte (espaciadores autoreplicativos).[13]​[30]​ Pueden añadirse rápidamente espaciadores nuevos como resuesta a una infección por un fago.[31]​

Genes cas y subtipos de CRISPR

Los genes asociados a CRISPR, los genes cas, son genes frecuentemente son relacionados con los arreglos de repetidos CRISPR. Análisis extensivos de genómica comparativa han identificado a muchos genes cas diferentes; un análisis inicial de 40 genomas de bacterias y arqueas sugirió que podría haver 45 familias de genes cas, con sólo dos genes, cas1 y cas2, siendo omnipresentes. [28]​ El sistema actual de clasificación de CRISPR agrupa a los operones en cas en tres grupos mayores, cada uno con múltiples subdivisiones basadas en filogenia de cas1 y en el complemento del operón del gen cas.[32]​ Apartde de cas1 y cas2, las tres divisiones mayores tienen conjuntos muy diferentes de genes constitutivos, con cada una de las divisiones conteniendo un ‘gen característico’ encontrado exclusivamente en esa subdivisión. Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas sugiriendo que son compatibles e inclusive podrían compartir elementos.[33]​[34]​ La distribución esporádica de los subtipos de CRISPR/Cas sugiere que el sistema está sujeto a la transferencia genética horizontal durante la evolución microbiana.

Genes característicos y sus funciones puativas para los tipos de CRISPR-Cas
Tipo Cas Gen característico Función Referencia
I Cas3 Nucleasa para ADN de cadena sencilla. Helicasa dependiente de ATP [35]​
IA Cas8a Subunidad del módulo de interferencia [36]​
IB Cas8b
IC Cas8c
ID Cas10d Contiene un dominio homólogo al dominio de las polimerasas de ácidos nucleicos y ciclasas de nucleótidos [32]​[37]​
IE Cse1
IF Csy1 Indeterminado
II Cas9 Las nucleasas RuvC and HNH, juntas, producen cortes en cadena doble, y de manera separada pueden producir cortes en cadena sencilla [38]​
IIA Csn2 Indeterminado
IIB Cas4 Indeterminado
IIC Caracterizado por la ausencia ya sea de Csn2 o Cas4 [39]​
III Cas10 Homólogo de Cas10d y Cse1 [37]​
IIIA Csm2 Indeterminado
IIIB Cmr5 Indeterminado

Mecanismo

Las etapas de inmunidad CRISPR por cada uno de los tres tipos mayores de inmunidad adaptativa. (1) Comienza la adquisición por el reconocimiento de ADN invasor por Cas1 and Cas2 y hay corte de un protoespaciador. (2) El protoespaciador se liga a repetidos directos adyacentes a la secuencia líder y (3) la extensión de cadena sencilla repara el CRISPR y duplica el repetido directo. El procesado e interferencia de ARNcr ocurren diferentemente en cada uno de los tres sistemas mayores de CRISPR. (4) El transcrito primario de CRISPR es cortado por los genes cas para producir ARNcr. (5) En sistemas tipo I, Cas6e/Cas6f cortan en la unión de ARN de cadena sencilla y ARN de cadena doble formada por vueltas tipo "hairpin" en el repetido directo. Los sitemas tipo II usan un ARN trans-activador (tracr) para formar ARN de cadena doble, el cual es cortado por Cas9 y la RNasaIII. Los sistemas tipo II usan un homólogo de Cas 6 que no requiere vueltas tipo hairpin en los repetidos directos para efectuar el corte. (6) En los sistema II y III, se hace un recorte secundarip ya sea en el extremo 5’ o 3’ para producir ARNcr maduros. (7) Los ARNcr maduros se asocian con las proteínas cas para formar complejos de interferencia. (8) En sistemas tipo I y II, el apareamiento de bases entre el ARNcr y el PAM provoca la degradación del ADN invasor. En el tipo III los sistemas no requieren PAM para la degradación exitosa y en los sistemas tipo III-A el apareamiento de bases ocurre entre ARNcr y ARNm en vez de con ADN, dirigido por los sistemas tipo III-B.

Adquisición de los espaciadores dentro de los locus de los CRISPR

Capturar al ADN invasor e integrarlo en un locus CRISPR en forma de un espaciador es la primera etapa en la respuesta inmune. La prevalencia de cas1 y cas2 fue la primera piste de que estaban involucrados en la adquisición de los espaciadores ya que todos los CRISPRs comparten la estructura repetitiva regular. Estudios de mutaciones confirmaron esta hipótesis ya que al remover cas1 o cas2 impedía la adquisición de espaciadores, sin afectar la respuesta inmune CRISPR en sí.[36]​[40]​[41]​[42]​[43]​ La función exacta de Cas1 y Cas2 se desconoce, sin embargo un número de proteínas Cas1 se han caracterizado bioquímicamente y se han resuelto sus estructuras.[44]​[45]​[46]​ Las proteínas Cas1 tienen secuencias de aminoácidos muy diversas, sin embargo sus estructuras cristalinas son sorprendentemente similares y todas las cas1 purificadas son nucleasas dependientes de metales que se unen a ADN en modo indpendiente de secuencia.[33]​ Las proteínas Cas2 representativas también han sido caracterizadas y poseen actividad específica de endoribonucleasa ya sea para ARN de cadena sencilla o ADN de cadena doble [47]​ [48]​[49]​ Los datos funcionales y estudios de mutación genética sugieren que Cas1 y Cas2 cortan fragmentos de ADN invasor y los insertan en arreglos CRISPR.

El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que fueron cortados como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que éstos no estaban distribuidos aleatoriamente en sino más bien se econtraban adyacentes a secuencias cortas de ADN (de 3 a 5 pb) llamadas PAMs (protospacer adjacent motifs en inglés). El análisis de los sistemas CRISPR-Cas de las tres divisiones mayores han mostrado que los PAms son importantes para los sistemas tipo I y II, pero no para el III durante el proceso de adqusición de espaciadores.[15]​[50]​[51]​[52]​[53]​[54]​ En sistemas tipo I y II, los protoespaciadores se cortan es posiciones adyacentes a una secuencia PAM, con el otro extremo del espaciador siendo cortado con un mecanismo tipo regla inherente a la proteína Cas1, manteniendo así la regularidad en tamaño de los espaciadores a lo largo del arreglo de CRISPR.[55]​[56]​ La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar ligado evolutivamente a cas1 y a la secuencia líder.[54]​[57]​

Los nuevos espaciadores se añaden a un arreglo de CRISPR en un modo direccional,[13]​ ocurriendo preferencialmente [50]​[51]​[58]​[59]​[60]​ pero no exlusivamente, adyancentes [53]​[56]​ a la secuencia líder. El análisis del sistema tipo I-E de E. coli ha demostrado que el primer repetido directo, adyacente a la secuencia líder, es copiado, con el espaciador recientemente adquirido siendo insertado entre el primer y segundo repetidos directos. [42]​[55]​ La secuencia PAM también parece ser importante durante la inserción de espaciadores den sistemas tipo I-E. La secuencia PAM del sistema I-E contiene un nucleótido final fuertemente conservado (adyacente al primer nucleótido del protoespaciador) y se ha mostrado que este nucleótido se convierte en la base final en el primer repetido directo.[43]​[61]​[62]​ Esto sugiere que la maquinaria de adquisición de espaciadores genera overhangs de cadena sencilla en la penúltima posición del repetido directo y en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen tener este mecanismo ya que los PAMs caracterizados en otros organismos no muestran el mismo nivel de cobservación en la posición final.[57]​ Es probable qye en esos sistemas, un extremo romo es generado al final del repetido directo y el protoespaciador durante la adquisición. Análisis reciente de CRISPRs de Sulfolobus solfataricus han revelado más complejidades al modelo canónico de la inserción de espaciadores ya que uno de sus seis locus insertó espaciadores de manera aleatoria a lo largo de su arreglo CRISPR, opuesto a una inserción más cercana a la secuencia líder.[56]​

Ha sido notado en una cantidad de CRISPRs que estos contienen muchos espaciadores para el mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno ha sido dilucidado recuentemente en el sistema tipo I-E de E. coli. Una mejora significativa en la adquisición de espaciadores ha sido detectada donde ya hay espaciadores con el fago como objetivo inclusive con "mismatches" al protoespaciador. Este ‘cebado’ requiere que tanto las proteínas Cas involucradas en adquisición como en interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores nuevamente adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma cadena que la del espaciador original que produjo el cebado.[43]​[61]​[62]​ Esta observación ha llevado a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición recorre el ADN extraño después del cebado para encontrar un nuevo protoespaciador.[62]​

Etapa de interferencia

La respuesta inmune por CRISPR ocurre en dos etapas: la biogénesis de CRISPR-ARN (ARNcr) y la interferencia guiada por ARNcr. Un arreglo de CRISPR es transcrito de un promotor en el líder en un sólo transcrito largo.[36]​[63]​[64]​ Este transcrito es procesado por cortes dentro de las secuencias repetidas para formar ARNcr. Los mecanismos para producir ARNcr maduros varían de gran manera entre los tres sistemas principales de CRISPR-Cas. Tanto en sistemas del tipo I-E como I-F las proteínas Cas6e y Cas6f respectivamente, reconocen giros [65]​[66]​[67]​ creados por la naturaleza palindrómica de los repetidos directos.[29]​ Esas proteínas cortan el transcrito primario en la unión entre los ARN de cadena sencilla y doble, dejando un extremo 5ʹ de 8 nucleótidos originado del repetido en los ARNcr maduros y con una secuencia espaciadora. Los sistemas tipo III también utilizan Cas6, sin embargo los repetidos encontrados en sistemas de tipo III no producen giros, sino que los cortes ocurren por el "enroscamiento" del transcrito primario a lo largo de la Cas6 para permitar corte to allow cleavage de 8 nucleótidos río arriba de la unición de los espaciadores repetidos.[68]​[69]​[70]​ Los sistemas tipo II no poseen el gen Cas6 así que utilizan a la ARNsaIII para hacer los cortes. Los sistemas funcionales tipo II codifican un pequeño ARN adicional que es complementario a la secuencia de los repetidos conocido como ARN trans-activador(tracrRNA).[40]​ La transcripción del tracrRNA y del transcrito primario CRISPR resulta en apareamiento de bases u la formación de ARN de doble cadena en la secencia de repetidos, la cual es subsecuentemente cortada por la ARNasaIII para producir ARNcr. A diferencia de los otros dos sistemas el ARNcr no contiene al espaciador completo, está truncado en un extremo por 10 nucleótidos.[38]​

Los ARNcr se asocian con las proteínas Cas para formar complejos de ribonucleótidos que reconocen ácidos nucleicos extraños. Expremientos con fagos y plásmidos han indicado que los ARNcr no tienen preferencia por cadenas codificantes o no codificantes, lo cual indica un sistema específico para ADN guiado por ARN.[6]​ [36]​[43]​[71]​[72]​[73]​[74]​ El complejo tipo I-E (llamado Cascade de forma común) requiere cnico proteínas Cas arregladas en una configuración que recuerda a un caballo de mar, unidas al ARNcr de cadena sencilla que estpa unido a lo largo del "lomo".[75]​[76]​ Durante el estado de interferencia en los sistemas tipo I la secuencia PAM es reconocida en la cadena complementaria al ARNcr y se requiere junto con el apareamiento de ARNcr. En los sistemas tipo I, el correcto apareamitno entre el ARNcr y los protoespaciadores señaliza un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradación del ADN.

Los sistemas de tipo II utilizan una proteína multifuncional, Cas9, para el paso de interferencia.[38]​ La Cas9 requiere tanto al ARNcr como al tracrRNA para funcionar y corta al ADN usando sus dominios duales de endonucleasa: HNH y RuvC. El apareamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago también se requiere en los sistemas tipo II, sin embargo el PAM es reconocido en la misma cadena que el ARNcr (la cadena opuesta a los sistemas tipo I).

Los sistemas tipo III, como los de tipo I, requieren un complejo multiproteico para asociarse con el ARNcr. Análisis bioquímicos y estructurales de S. solfataricus y Pyrococcus furiosus han dilucidado que seis o siete proteínas cas se unen a los ARNcr, respectivamente.[77]​[78]​ Sorpredentemente, los sistemas tipo III analizados en S. solfataricus y P. furiosus son específicos para el ARNm de fagos y plásmidos,[34]​[78]​ lo cual puede hacer a esos sitemas capaces de ser específicos para genomas de fagos basados en ARN.[33]​

El mecanismo para distinguir ADN propio del externo durante la interferencia está dentro de los ARNcr y por lo tanto se infiere que es conservado en los 3 sistemas. Aun a través del proceso de maduración distinitva de cada uno de los tipos, todos los ARNcr contienen una secuencia espaciadora y una porción del repetido en uno o ambos extremos. Es la secuencia parical de repetidos la que previene que el sistema CRISPR-Cas ataque al cromosoma ya que el apareamiento de bases más allá de la secuencia del espaciador es una señal de que pertenece así mismo y previene el corte de ADN en el cromosoma.[79]​ Las enzimas de CRISPR guiadas por ARN se clasifican como enzimas de restricción tipo V.


Proteína asociada a CRISPR
Estructura cristalina de una proteína asociada a CRISPR de Thermus thermophilus
Identificadores
Símbolo CRISPR_assoc
Pfam PF08798
clanPfam CL0362
InterPro IPR010179
CDD cd09727
Proteína asociada a CRISPR Cas2
Estructura cristalina de la proteína hipotética tt1823 de Thermus thermophilus
Identificadores
Símbolo CRISPR_Cas2
Pfam PF09827
InterPro IPR019199
CDD cd09638
Proteína asociada a CRISPR Cse1
Identificadores
Symbol CRISPR_Cse1
Pfam PF09481
InterPro IPR013381
CDD cd09729
Proteína asociada a CRISPR Cse2
Identificadores
Símbolo CRISPR_Cse2
Pfam PF09485
InterPro IPR013382
CDD cd09670


Evolución y diversidad

Estudios en Streptococcus thermophilus fueron los primeros indicativos de cómo los CRISPRs mueven a la evolución de fagos y bacterias. Un espaciador CRISPR debe corresponer perfectamente a la secuencia del gen objetivo del fago. Los fagos pueden seguir infectando a sus hospederos cuando hay mutaciones puntuales en el espaciador.[79]​ Requiermientos similares se siguen en el PAM o la cepa seguirá siendo sensible a fagos.[51]​[79]​ El modelo básico de evolución CRISPR se explica como el modelo donde los espaciadores recientemente incorporados llevan a los fagos a mutar sus genomas creando diversidad en las poblaciones tanto de fagos y bacterias.

La evolución CRISPR ha sido estudiada usando a la genómica comparativa de muchas cepas de S. thermophilus, Escherichia coli y Salmonella enterica. Un estudio de 124 cepas de S. thermophilus mostró que 26% de todos los espaciadores eran únicos y que los fierentes locus de CRISPR mostraban diferentes tasas de adqusición de espaciadores.[50]​ Los resultados mostraton que un locus de CRISPR particular puede evolucionar más rápidamente que otros, lo cual ayuda a establecer relaciones filogeenéticas entre cepas. Un análisis similar de cepas de E. coli y S. enterica reveló que evolucionaron mucho más lentamente que S. thermophilus. Las cepas de esta última que habían divergido hace más de 250,000 años todavía contenían el mismo complemento de espaciador.[80]​

La diversidad de CRISPR fue estudiada en múltiples comunidades ambientales usando metagenómica. El análisis de los biofilms de los drenajes ácidos de dos minas mostraron que uno de los CRISPRs analizados contenía deleciones y espaciadores extensivas en comparación al otro biofilm, lo cual sugiere una mayor actividad de fagos en una comunidad en comparación con otra.[59]​ En la cavidad oral, un estudio temporal determinó que aproximademente del 7 al 22% de los espaciadores eran compartidos en períodos en el tiempo a lo largo de 17 meses en un mismo individuo y menos del 2% de los espaciadores fueron compartidos entre diferentes individuos en cualquier período en el tiempo. [60]​ Del mismo ambiente, una cepa particular fue aislada usando primers de PCR específicos para su CRISPR. A diferencia de los resultados generales de la presencia/ausencia de los espaciadores, los cuales mostraban diversidad significativa, este CRISPR añadió 3 espaciadores a lo largo de 17 meses,[60]​ sugiriendo que aun en un ambiente con diversidad importante de CRISPR, algunos locus evolucionan lentamente. Los CRISPRs también han sido analizados desde los metagenomas producidos por el proyecto del microbioma humano.[81]​ Aunque la mayoría de los CRISPRs eran específicos en un sitio, algunos CRISPRs dentro del sitio eran ampliamente encontrados entre individuos. Uno de esos locus de CRISPR se origino con estudios de especies de Streptococcus y contuvieron ~15,000 espaciadores, 50% de los cuales eran únicos. De modo similar a los estudios dirigidos de la cavidad oral, algunos de los CRISPRs mostraton poca evolución entre períodos en el tiempo.[81]​

La evolución CRISPR ha sido estudiada en quimiostatos usando a S. thermophilus para examinar de manera explícita la tasa de adquisición de espaciadores. En el período de una semana, cepas de S. thermophilus adquirieron hasta tres espaciadores cuando eran expuestos ante sólo un fago.[82]​ En el mismo período de tiempo, el fago desarrolló varios SNPs que se quedaron fijos es la población, sugiriendo que CRISPR había prevenido la repliación de todos los otros tipos de fagos sin estas mutaciones.[82]​ Otros exprimentos, también con S. thermophilus, mostraton que los fagos pueden infectar y replicarse en hospederos que tienen sólo un espaciador y que los hospederos sensibles existen en ambientes con altas concentraciones de fagos.[83]​ Los estudios por quimiostatos y observaciones en los CRISPRs sugieren muchas consecuencias al resultado de la evolución de CRISPR y fagos.

Identificación bioinformática de los CRISPR en genomas y metagenomas

Los CRISPRs están altamente distribuidos entre bacterias y arqueas [32]​ y muestran similitudes en las secuencias,[29]​ sin embargo su característica principal son sus espaciadores repetidos y repetidos directos. Esta característica hace a los CRISPRs fáciles de indentificar el largas secuencias de ADN, ya que el número de copias repetidas disminuye la posibilidad de una unión tipo falso positivo. En la actualidad hay tres programas utilizados para la identificación de repetidos CRISPR que buscan repetidos interespaciados en secuencias grandes: CRT,[84]​ PILER-CR [85]​ y CRISPRfinder.[86]​

El análisis de los CRISPRs en los datos de metagenómica es mucho más demandante, ya que los locus de CRISPR no suelen asemblarse debido a su naturaleza repetitiva ni por variación de cepas, lo cual confunde a los algoritmos. Mientras que hay muchos genomas de referencias disponibles, la PCR se puede utilizar para amplificar arreglos de CRISPR y así analizar el contenido de los espaciadores. [50]​[60]​[87]​[88]​[89]​ Sin embargo, este enfoque sólo dará información de CRISPRs específicamente buscados y en organismos con suficiente representación en bases de datos públicas para poder hacer el diseño de primers de PCR confiables.

El enfoque alterativo es extraer y reconstuir los arreglos de CRISPR arrays basándose en datos shotgun metagenómicos. La identificación de los arreglos de CRISPR de lecturas metagenómias es una tarea computacionalmente más difícil, particularmente con las tecnologías de decuenciación de segunda generación (como son 454, Illumina), ya que las longitudes cortas previenen que más de dos o tres unidades repetidas se presenten en una sóla lectura. La identificación de CRISPR en lecturas crudas es lograda usando puramente identificaión denovo [90]​ o al usar secuencias repetidas directas en arreglos CRISPR parcialmente ordenados [81]​ y secuencias repetidas de genes publicados [91]​ como herramienta para identificar repetidos directos en lecturas individuales.

Importancia evolutiva

Un estudio bioinformático mostró que los CRISPRs son evolutivamente conservados y que se pueden aglomerar en tipos relacionados. Muchos muestran la posibilidad de una estructura secundaria conservada.[29]​

A través del mecanismo CRISPR/Cas, las bacterias pueden adquirir immunidad a ciertos fagos y por ende detener la consecuene transimisión de estos fagos. Por esta razión los CRISPR/Cas se describen como un mecanismo de herencia Lamarckiano .[92]​ Otros han investigado la coevolución de los genomas vitales y hospederos.[93]​

Las proteínas Cas9 están altamente enriquecidas en bacterias patogénicas y comensales. La regulación mediada por CRISPR/Cas puede contribuir a la regulación de los genes endógenos bacterianos, particularmente en la interacción bacteriana con hospederos eucariontes. Por ejemplo, la proteína Cas9 de Francisella novicida usa un pequeño y único ARN asociado a CRISPR/Cas para reprimir un transcrito endógeno que coficia para una lipoproteína bacteriana que es crítica para F. novicida para reducir la respuesta del hospedero y promover la virulencia.[94]​

Aplicaciones

La prueba que demostró el principio de la redirección específica del sistema CRISPR/Cas llegó en 2012[95]​ y fue un primer paso para la materialización de propuestas para la biotecnología derivada de CRISPR:[96]​

  • Inmunización artificial contra fagos por introducción de locus CRISPR en bacterias industrialmente importantes, incluyendo a esas utilizadas en la producción de comida y fermentaciones a gran escala.
  • La ingeniería genética a nivel celular u organísmico al reprogramar un sistema CRISPR/Cas para lograr ingeniería del genoma guiada por ARN. Los estudios lo han demostrado tanto in vitro[17]​[97]​ como in vivo[24]​[98]​[99]​[100]​
  • Discriminación de cepas bacterianas por comparación de secuencias espaciadoras

Terapias

Editas Medicine, una start up de 43 millones de dólares, busca desarrollar tratamientos que usen CRISPR/Cas para hacer ediciones desde pares de bases específicas hasta segmentos más grandes de ADN. Algunas enfermedades heredadas como la fibrosis quística y la anemia son causadas por mutaciones de un sólo par de bases; la tecnología CRISPR/Cas tiene el potencial de corregir esos errores. El gen "corregido" permanece en su lugar habitual en su cromosoma, quien contiene la forma en que la célula normalmente activa o inhibe su expresión.[101]​

Después de cultivar precursores de células sanguíneas llamados hemocitoblastos de la médula ósea de un paciente, la cirugía genética con CRISPR podría corregir el gen defectuoso. Entonces las células con el genoma corregido serían reintroducidas a la médula del paciente, que ahora producirá células sanas. Reemplazar el 70% de las células defectuosas significaría tener una cura.[27]​

Antes de que pueda usarse clínicamente, la compañía debe poder garantizar que sólo la región objetivo será afectada y debe determinar cómo entregar la terapia a las células del paciente.[101]​

Otras patologías que se podrían tratar con CRISPR incluyen la enfermedad de Huntington, los efectos de la vejez, esquizofrenia y autismo e inclusive la modificación de ADN en embriones vivos.[27]​

Mejorar el sistema de dirección es fundamental antes de que CRISPR pueda ser utilizado en aplicaciones médicas. Los ARN guía existentes podrían trabajar sobre secuencias que difieren en algunas pares de bases de la secuencia objetivo.[16]​

En 2014, investigadores de la UCSF usaron a los CRISPR para crear crear bersopnes sanas de células madre de pacientes con beta-talasemia patients.[102]​

Modelos murinos

CRISPR simplifica la creación de modelos de ratones y reduce el tiempo requerido de meses o más a tan sólo semanas. El knockdown de genes endógenos ha sido logrado por transfección con un plásmido que contiene un área CRISPR con un espaciador, que inhibe un gen objetivo. La inyección de cigotos de ratón con Cas9 y dos ARN guía pudo lograr desactivar dos genes con el 80% de eficacia. La llamada reparación dirigida por homología involucrs el uso de Cas9 para "cortar" al ADN, y así introducir nuevas partes génicas al cigoto.[cita requerida]

Agricultura

En 2014, el investigador chino Gao Caixia aplicó para patentes para la creación de una cepa de trigo que es resistente al oídio. A la cepa le faltan genes que producen proteínas que reprimen las defensas en contra del oídio. Los investigadores borraton todas las copias de los genes del genoma hexaploide del trigo.La cepa promete reducir o eliminar el gran uso de fungicidas para controlar la enfermedad. Gao usó los sistemas de edición génica Transcription activator-like effector nuclease(TALENs) y CRISPR agregar o cambiar ningún otro gen. Aún no han habido pruebas de campo.[103]​[104]​

Funciones

Edición

Los CRISPRs pueden agregar y eliminar pares de bases en locus de ADN altamente específicos. Se han usado los CRISPRs para cortar más de cinco genes a la vez.[16]​

Knockdown reversible

Los "CRISPRi", análogos a los ARNi, apagan los genes en un modo reversible al ser específicos pero sin hacer cortes. En bacterias, la presencia es lo único que se necesita para detener la transcripción, pero en aplicaciones de mamíferos, una sección de proteína es añadida. Guía al ARN que es específico para el ADN regulatorio, que son promotores que preceden al gen de interés.[16]​

Activación

La Cas9 se usó para llevar factores de transcripción sintéticos (fragmentos proteicos que encienden genes) que activaban genes humanos específicos. Esta técnica logró un fuerte efecto al dirigir múltiples constructos de CRISPR a lugares ligeramente diferentes en el promotor del gen.[16]​

Los genes incluían algunos atados a enfermedades humanos, diferenciación muscular, cáncer, inflamación y de producción de hemoglobina fetal.[16]​

Uso por fagos

Otro mecanismo para la defensa de las bacterias contra invasión de fagos es teniendo islas genómicas. Un subtipo de islas llamada "phage-inducible chromosomal island" (PICI) es cortada del cromosoma bacteriano cuando se presenta la infección por fago y puede inhibir su replicación.[105]​ Los mecanismos que inducen el sistema PICI y cómo PICI inhibe la replicación del fago no se tienen entendidos hasta ahora. Un estudio mostró que el fago lítico ICP1, el cual específicamente ataca al serotipo 01 de Vibrio cholerae ha adquirido un sistema CRISPR/Cas que apunta a un elemento de tipo PICI en V. cholera. El sistema tiene dos locus CRISPR y 9 genes Cas. Parece ser que es homólogo al sistema 1-F system encontrado en Yersinia pestis. Además, igual que el sistema bacteriano CRISPR/Cas el sistema ICP1 CRISPR/Cas puede adquirir nuevas secuencias, lo cual permite al fago co-evolucionar con su hospedero. host.[106]​

Automatización y soporte de librerías

Existe software gratuito para diseñar ARN para "targetear" cualquier gen deseado. El repositorio de Addgene ofrece a los académicos a posibilidad de crear su propio sistema CRISPR system por 65 dólares En 2013 Addgene distribuyó más de 10,000 constructos de CRISPR. La asociación ha recibido sequencias génicas activadoras de CRISPR de 11 equipos de investigación independientes.[16]​

Patente

Una aplicación de patente providional sobre el uso del sistema CRISPR para la edición de genes y regulación de expresión génica fue solicitada por el equipo de Doudna el 12 de mayo de 2012. Aplicaciones subsecuentes fueron combinadas el 6 de marzo de 2014, con los resultados siendo publicados por el organismo USPTO.[107]​ Los derechos de patente han sido asignados por los inventores a los regentes de la Universidad de California y la Universidad de Viena.

Desde entonces, Feng Zhang en el Broad Institute, quien había desarrollado y demostrado la tecnología CRISPR en células humanas, ha obtenido una patente de CRISPR en células con núcleo: células de humano, animal y planta. De acuerdo con Zhang, las predicciones de Doudna en su propia aplicación de patente de que su descubrimiento podría funcionar en humanos, fueron una "mera conjetura", y que, en otra mano, él fue el primero en demostrarlo, en un acto de invención separado y "sorprendente".[108]​ Esta segunda patente es controversial, ya que otros científicos sugieren que en términos de patente, era "obvio" que la tecnología CRISPR funcionaría en células humanas y que la "invención de Zhang no era merecedora de una patente propia.[108]​ Desde diciembre de 2014, se espera que Doudna y Charpentier monten una interferencia en contra de la patente del Broad Institute.[108]​

Ver también

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