Criopreservación

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La criopreservación es el proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 ºC y -196 ºC (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas.

Características[editar]

Normalmente para preservar una muestra biológica durante el mayor tiempo posible sin que pierda su calidad se utiliza nitrógeno líquido. De esta manera sumergiendo la muestra en nitrógeno líquido se alcanzan temperaturas entre -80 y -195,79 ºC (la temperatura de ebullición del nitrógeno líquido). La utilización de helio líquido permite alcanzar temperaturas incluso menores de hasta -268,93 ºC (temperatura de ebullición del helio), aunque este es mucho más caro. A estas temperaturas cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que producen la muertes de los organismos, quedan totalmente detenidos por congelación. Las muestras criopreservadas en nitrógeno líquido sólo estarán afectadas por las radiaciones que puedan incidir sobre ellas puesto que la congelación impide todo movimiento molecular en la muestra.El problema lo constituyen el proceso de congelación previo y la descongelación posterior que es lo que afecta gravemente a las muestras por los siguientes motivos:

  • Formación de cristales de hielo durante la congelación del agua

Estos cristales se forman tanto fuera como dentro de la célula y son los cristales intracelulares los que comportándose como cuchillas cortan las estructuras internas de la célula, especialmente las membranas.

  • El hielo es dinámico

El hielo no es inerte, entre los 0 y los -30º el hielo cambia continuamente de conformación lo que provoca que se acentúe el efecto "cuchilla" del mismo.

Debido a estos efectos durante la congelación se debe evitar la formación de hielo intracelular siguiendo una serie de reglas:

  • Deshidratar la célula. Hay que extraer el agua de la célula y sustituirla por crioprotectores o criopreservantes que mantengan el equilibrio osmótico. Si la célula llega al 30% de deshidratación se alcanza un punto de no retrono, a partir del cual las condiciones biológicas son irrecuperables (Merymann, 1968).
  • Tipos de crioprotectores.

- Agentes penetrantes: Crioprotectores con bajo peso molecular, permeables a través de la membrana. Desplazan el agua intracelular evitando la formación de cristales de hielo. Se utilizan para congelaciones a velocidad lenta.

- Agentes no penetrantes: Son crioprotectores con un alto peso molecular, y por lo tanto no permeables a través de la membrana. Promueven la rápida deshidratación celular. Se utilizan para las congelaciones a velocidades altas. Un ejemplo de ellos son los azúcares: sacarosa, glucosa, trealosa...

  • Controlar la velocidad de congelación. Hay que controlar la velocidad de congelación para que la formación de los cristales intracelulares sea lo menos dañina posible. Si la congelación se produce demasiado rápido se forma el hielo intracelular y si se da demasiado lento se produce el colapso celular.
  • Ralentizar el metabolismo celular. Para ello se trabaja a temperatura ambiente o a 4ºC.
  • Descongelación. Para realizar la descongelación se debe eliminar rápidamente la presencia intra y extracelular de los crioprotectores que suelen ser tóxicos a las elevadas concentraciones utilizadas. Se debe atemperar de manera correcta la muestras hasta su temperatura de cultivo.

Como regla general podemos afirmar que apróximadamente el 50% de las células que congelamos no sobrevivirán a la descongelación. Actualmente se ha logrado superar esta etapa y de la congelación se ha pasado a la vitrificación, de tal forma que con este nuevo método se consigue que no se creen cristales de hielo y sobrevivan la práctica totalidad de todas las células inmersas en el proceso.

Criopreservantes[editar]

Un criopreservante es un compuesto químico que permite el mantenimiento de un tejido o de células por mucho tiempo cuando se las mantiene a baja temperatura. Los criopreservantes se catalogan de acuerdo a la velocidad para penetrar los tejidos, el grado de protección al cristal de agua que confieren y por la toxicidad química que pueden tener sobre las células. El grado de protección a las células está directamente vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para la cristalización dañina. Además, estos productos se utilizan en conjunto con los medios nutritivos líquidos que conforman las mezclas congelantes.

Aplicación[editar]

Las concentraciones criopreservantes son lamentablemente tóxicas para el tejido a temperatura ambiente, por lo cual, en el procedimiento de congelado, se deben respetar ciertos tiempos de exposición del material a 4° C, para que el producto protector penetre el tejido sin alcanzar los niveles tóxicos referidos, antes del inicio del proceso de congelamiento propiamente tal. En el mismo sentido, cuando se procede a la técnica de descongelado, previo al uso del material, se lo debe someter a un lavado minucioso con medios nutritivos a concentraciones decrecientes del criopreservante, para su total eliminación evitando de esa forma los efectos tóxicos.

Criopreservantes[editar]

Podemos distinguir dos tipos: agentes penetrantes y agentes no penetrantes.

Agentes penetrantes Son compuestos de bajo peso molecular y permeables a través de la membrana. Actúan desplazando el agua del interior de la célula evitando así la formación de cristales de hielo intercelulares los cuales actúan como cuchillos. Estos criopreservantes se utilizan en congelaciones a velocidad muy lenta y los más comunes son:

Agentes no penetrantes Son compuestos de elevado peso molecular que no son permeables a través de la membrana sino que actúan fuera de la célula promoviendo una rápida deshidratación de la misma. Se utilizan en congelaciones a velocidades muy altas y los más conocidos son:

Además se ha observado que la glucosa, la trealosa y otros glúcidos pueden actuar como criopreservantes naturales.[1]

Descongelación Durante la descongelación se debe eliminar rápidamente la presencia intra y extracelular de los crioprotectores que suelen ser tóxicos a las elevadas concentraciones utilizadas. Adicionalmente se ha de tener en cuenta que la muestra debe ser atemperada de manera correcta hasta su temperatura de cultivo.

Elementos de una unidad de criopreservación[editar]

Cámara de congelación[editar]

Como su nombre lo indica es la unidad que permite congelar o "criopreservar" la muestra biológica por largo tiempo, preservando al mismo tiempo su viabilidad. Un sistema controlado por computadora controla el grado de congelación del vapor del nitrógeno para evitar el deterioro de la célula por fenómenos osmóticos o por la cristalización del agua.

Unidad de almacenamiento[editar]

Es en donde se almacena la muestra después de que esta ha alcanzado la temperatura deseada. Ya en esta unidad a la muestra se le colocan gradillas adecuadas al volumen y al tipo de muestra.


La criopreservación es útil para las técnicas de reproducción asistida, a las cuales acuden parejas con problemas de fertilidad. Así se congela el semen del donante, con el fin de realizar varios intentos de fecundación del óvulo en el momento más adecuado.

Criopreservación en reproducción asistida[editar]

Criopreservación de espermatozoides[editar]

Esta criopreservación va a resultar muy interesante a la hora de querer conservar muestras de pacientes que por ejemplo van a someterse a un tratamiento de quimioterapia. Como vamos a disponer de millones vamos a necesitar estandarizar el método. De esta forma, vamos a encontrar cuatro métodos:

1) Método 1: Alicuotar en pequeños volúmenes (menos de 0,5 ml) con un volumen igual de medio de congelación y sumergir en nitrógeno líquido.

2) Método 2: Añadir el crioprotector y mantener 45 minutos a 4ºC previo a sumergir en nitrógeno.

3) Método 3: Incubar a 4ºC y formar gotas sobre un bloque de CO2 sólido.

4) Método 4: Incubar a 4ºC y mantener dos horas en vapores de nitrógeno. De esta forma se simula una rampa suave de congelación.

5) Método 5: Usar un congelador biológico programable.

A pesar de la existencia de cuatro métodos, sólo a partir del tercero se van a obtener tasas de supervivencia aceptables, es decir, que sean superiores al 50%.

La solución de congelación será medio estándar de espermatozoide, tampón pH, antibióticos y crioprotectores como el glicerol o la yema de huevo.

Se ha observado que sólo a partir del tercer método se obtienen tasas de supervivencia aceptables que están por encima del 50%. No obstante la supervivencia también va a depender del volumen de congelación y del sistema de envasado utilizado que puede ser mediante pajuelas, criotubos o ampollas.

La descongelación de las muestras se realizará a temperatura ambiente. Además se realizará un lavado con medio de cultivo y una incubación a 37ºC para una recuperación de la movilidad (esto último de forma opcional).

Criopreservación de embriones[editar]

En este caso la supervivencia va a ser más crítica que en la ciropreservación de los espermatozoides. En primer lugar es necesario aclarar unos conceptos clave:

  • Su tasa de supervivencia va a ser inferior a la de los espermatozoides.
  • Se considera que un embrión ha sobrevivido a la congelación si tiene la mitad o más de sus células con las que se congeló intactas y si tras ponerlo en cultivo se obtiene un embrión en día 3 o día 5-6 de buena calidad.
  • Sólo se podrá llevar a cabo con un congelador programable y un buen protocolo.
  • Cuando un embrión sobrevive intacto sus posibilidades de implantar van a ser las mismas que en fresco.
  • En el caso de que tras la congelación el embrión tenga más de la mitad de sus células lisadas, tendrá menos posibilidades de implantar.

La congelación de los embriones se va a llevar a cabo con los embriones sobrantes de un tratamiento de reproducción asistida. De esta forma, las pacientes podrán en un futuro someterse a la transferencia de más embriones o podrán donarlos, tanto para otras parejas como para la investigación.

La criopreservación de embriones en división debe realizarse preferentemente en estados exponenciales de mitosis, es decir, cuando los embriones presentan 2,4,8 células. Esto es debido a que la respuesta de la célula al procedimiento de criopreservación varía durante el ciclo celular. En estados intermedios de clivaje algunas células se pueden encontrar en distintas etapas de división, incluso con el huso mitótico ensamblado. De modo que es posible provocar daños a nivel cromosómico puesto que las bajas temperaturas afectan a dicho huso.

La solución empleada en la congelación consta de un crioprotector llamado PROH, el cual está preparado en buffer fosfato alcalino (PBS) suplementado con un 20% de proteína y sacarosa. Habitualmente la tase de supervivencia por embrión está entre el 50 y el 70%. Pero cada estadio embrionario presenta sus características propias. En los siguientes puntos se describen sus tasas de supervivencia particulares y los componentes principales de sus medios de congelación:

  • Zigotos: 95% --> PrOH + sacarosa
  • Embrión en día 2: 75% --> PrOH + sacarosa
  • Embrión en día 3: 60% --> PrOH + sacarosa
  • Embrión en día 5-6: < 50% --> Glicerol + sacarosa
  • Aun así hay cohortes completas de embriones que no sobreviven a la descongelación sin explicación apararente en un 10% de las descongelaciones.

Criopreservación de ovocitos[editar]

Los ovocitos, de los elementos implicados en la reproducción asistida, es el material más sensible a la criopreservación. Este hecho se debe probablemente a que su placa metafásica es muy sensible. Los ovocitos sobreviven poco y mal a la congelación, siendo la tasa de gestación por ciclo de descongelación sólo del 10%. La tasa de implantación de los embriones conseguidos a partir de ovocitos criopreservados será de un 5% aproximadamente. De forma que hacen falta unos 60 ovocitos por gestación. Estos números dan a conocer y ponen de relieve la gran sensibilidad de los ovocitos a la criopreservación.

La congelación lenta parece haber llegado a un eficiencia máxima que no es del 100% y que es difícil de aplicar a blastocistos y sobre todo a los ovocitos.

La vitrificación es una técnica alternativa que se está introduciendo con éxito en la embriología.

Referencias[editar]

Véase también[editar]