Proteómica

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Preparación robótica de muestras para espectrometría de masas MALDI-TOF

Proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas, en particular de su estructura y función.[1] [2] Las proteínas son partes vitales de los organismos vivos, ya que son los componentes principales de las rutas metabólicas de las células. El término proteómica fue acuñado en 1997[3] como una analogía con genómica, el estudio de los genes. La palabra "proteoma" es la fusión de "proteína" y "genoma", y fue acuñada por Marc Wilkins en 1994, mientras trabajaba en ese concepto como estudiante de doctorado.[4] [5] El proteoma es la dotación completa de proteínas,[4] incluyendo las modificaciones hechas a un conjunto particular de proteínas, producidas por un organismo o sistema. Esto varía con el tiempo y con requisitos diferentes, o debido al estrés, que sufre una célula o un organismo.

La descripción del proteoma permite tener una imagen dinámica de todas las proteínas expresadas, en un momento dado y bajo determinadas condiciones concretas de tiempo y ambiente. El estudio y comparación sistemáticos del proteoma en diferentes situaciones metabólicas y/o patológicas permite identificar aquellas proteínas cuya presencia, ausencia o alteración se correlaciona con determinados estadios fisiológicos. En el caso concreto del análisis proteómico asociado a patologías concretas, es posible identificar proteínas que permitirían diagnosticar la enfermedad o pronosticar la evolución de la misma. Dichas proteínas se conocen con el nombre genérico de biomarcadores.[6]

La proteómica es una ciencia relativamente reciente. Para su despegue definitivo, ha sido necesaria la consolidación definitiva de la espectrometría de masas como técnica aplicada al análisis de moléculas biológicas y el crecimiento exponencial en el número de entradas correspondientes a genes y/o proteínas en las bases de datos. Esto, combinado con el empleo de potentes métodos de fraccionamiento y separación de péptidos y proteínas como el 2D-PAGE[7] (electroforesis de poliacrilamida de dos dimensiones) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), ha permitido consolidar la proteómica, desde mediados de los años 90 del siglo pasado, como ciencia para el análisis masivo de proteínas.

Complejidad del problema[editar]

La proteómica es considerada el siguiente paso en el estudio de un sistema biológico, luego de la genómica. Es más complicada que la genómica porque mientras que el genoma de un organismo es más o menos constante, el proteoma difiere de una célula a otra y de un momento a otro. Estos se debe a que en los distintos tipos de células se expresan genes distintos, lo que implica que se debe determinar hasta el conjunto básico de proteínas producido en una célula.Un factor adicional de complejidad son las modificaciones que puede sufrir la estructura o secuencia básica de la proteína, esto es, aquella que aparece codificada en el genoma. Dichas modificaciones provienen básicamente de dos fuentes: el recorte o Splicing alternativo[8] de los ARNm que codifican la proteína y las modificaciones postraduccionales (fosforilación, metilación, acetilación, etc) que normalmente sirven para modificar o modular la actividad,función o localización de una proteína en diferentes contextos fisiológicos o metabólicos. Ambas fuentes de complejidad incrementan sustancialmente el número de proteínas diferentes que pueden existir: se estima que a partir de los 25 000-30 000 genes que codifican proteínas en el genoma humano, podrían generarse un número de proteínas diferentes que oscilaría entre 500 000-1 000 000.

En el pasado, el análisis de los genes que se expresaban en diferentes tipos de células y tejidos y en diferentes contextos fisiológicos era realizado principalmente mediante un análisis de ARNm, pero se encontró que a menudo no existe una correlación directa entre el contenido en ARNm y el contenido proteico.[9] [10] Se sabe que el ARNm no siempre se traduce a proteína,[11] y que la cantidad de proteína producida por una cantidad dada de ARNm depende del estado fisiológico de la célula. No obstante, estudios recientes han confirmado que, al menos en levadura, existe una alta correlación entre el número de copias de ARNm y el de moléculas de proteína traducidas a partir de aquél.[12] Las técnicas proteómicas actuales permiten confirmar la presencia o ausencia de una o más proteínas concretas y determinar su cantidad, bien en valores absolutos o relativos[13]

Áreas de estudio[editar]

Las principales áreas de estudio de la proteómica son:

  1. Identificación de proteínas y caracterización de sus modificaciones postraducionales
  2. Proteómica de "expresión diferencial"
  3. Estudio de las interacciones proteína-proteína

Separación de proteínas[editar]

La enorme complejidad (varios miles de proteínas diferentes) del proteoma de la mayor parte de los organismos vivos obliga al empleo de diversas técnicas para separar las proteínas. Entre las técnicas más comunes se encuentran la electroforesis mono y bidimensional así como la cromatografía líquida en sus distintas variantes.

La técnica más extendida es la electroforesis en geles de poliacrilamida (llamada SDS-PAGE por sus siglas en inglés "Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis"). Se trata de una electroforesis en gel de poliacrilamida al que se le añade el detergente dodecilsulfato sódico con el fin de desnaturalizar las proteínas, asegurar que todas se encuentren cargadas y por tanto puedan migrar en un campo eléctrico en función de su masa molecular relativa (Mr). Una variante de este tipo de electroforesis es la electroforesis bidimensional o 2D-PAGE, en la que el fraccionamiento en geles SDS-PAGE es precedido por una separación basada en el punto isoeléctrico de las proteínas. La electroforesis 2D-PAGE permite alcanzar una mayor resolución y es por tanto utilizada en el análisis de proteomas muy complejos. Una vez realizado el fraccionamiento, distintos métodos de tinción (Azul Coomassie, tinción de plata, tinción Sypro Rubi, etc) permiten visualizar las proteínas separadas. La cromatografía líquida también se emplea en el fraccionamiento y separación de proteomas complejos. Las distintas variantes existentes permiten separar las proteínas en función de su hidrofobicidad (cromatografía de fase reversa), carga eléctrica (cromatografía de intercambio catiónico/aniónico) y tamaño (cromatografía de exclusión molecular).

Identificación de proteínas[editar]

Degradación de Edman[editar]

Espectrometría de masas[editar]

La espectrometría de masas (MS) permite analizar la composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los núcleos por su relación masa-carga. Presenta numerosas ventajas frente al método de Edman: es más sensible, permite analizar directamente las mezclas proteicas y ofrece un mayor rendimiento por muestra. Por ello, es el método utilizado en las dos técnicas de identificación de proteínas más comunes: la identificación por huella peptídica y el análisis MS/MS.

Identificación por huella peptídica[editar]
  • Digestión en gel: Normalmente, la muestra se reduce y alquila. A continuación, se añade una proteasa con una patrón de corte conocido (típicamente, tripsina), generándose una colección o conjunto de péptidos específicos de proteína. Habitualmente, esta colección de péptidos será lo suficientemente específica como para poder identificar la proteína con la que estamos trabajando.
  • Extracción de los péptidos
  • Análisis MS MALDI-TOF: este equipo traduce el tiempo de vuelo en masas, pues aunque todos los iones tienen la misma estructura y la misma carga, su peso es distinto.
  • Comparación del espectro de masas con la información almacenada en bases de datos de secuencias conocidas, como Swiss-Prot o nr-GenBank. Para ello existen motores de búsqueda como MASCOT que ordenan las proteínas identificadas asignándoles puntos en función del número de coincidencias.
Análisis MS/MS[editar]
  • Digestión solución
  • Extracción de los péptidos
  • Espectrometría de masas de ionización por electrospray
  • La comparación de los datos del espectro de fragmentación experimental con los almacenados en bases de datos es similar al llevado a cabo en la identificación por huella peptídica: las coincidencias entre los datos experimentales y los datos del servidor se muestran en orden decreciente de probabilidad.

Para evaluar la identificación de la proteína se ha de tener en cuenta su presencia en las bases de datos, maximizar la asignación de fragmentos generados y comprobar si las características de la proteína identificada y la proteína problema coinciden. No obstante, para mejorar la precisión de la identificación es recomendable repetir varias veces el proceso de identificación del péptido, para disponer así de varios espectros de fragmentación.

Interacciones proteína-proteína[editar]

La mayoría de la proteína funciona en colaboración con otras proteínas, y una meta de la proteómica es identificar cuales proteínas interactúan. Esto es especialmente útil para determinar socios potenciales en las cascadas de señalización celular.

Se dispone de varios métodos para probar las interacciones proteína-proteína. El método tradicional es el sistema de doble híbrido de la levadura. Los métodos nuevos incluyen microarrays de proteína, cromatografía de inmunoafinidad seguida por espectrometría de masas, interferometría de doble polarización y métodos experimentales como phage display y métodos computacionales.

Véase también[editar]

Bases de datos de proteínas[editar]

Centros de investigación[editar]

Referencias[editar]

  1. Anderson NL, Anderson NG (1998). «Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words». Electrophoresis 19 (11):  pp. 1853–61. doi:10.1002/elps.1150191103. PMID 9740045. 
  2. Blackstock WP, Weir MP (1999). «Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins». Trends Biotechnol. 17 (3):  pp. 121–7. doi:10.1016/S0167-7799(98)01245-1. PMID 10189717. 
  3. P. James (1997). «Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics.». Quarterly reviews of biophysics 30 (4):  pp. 279–331. doi:10.1017/S0033583597003399. PMID 9634650. 
  4. a b Marc R. Wilkins, Christian Pasquali, Ron D. Appel, Keli Ou, Olivier Golaz, Jean-Charles Sanchez, Jun X. Yan, Andrew. A. Gooley, Graham Hughes, Ian Humphery-Smith, Keith L. Williams & Denis F. Hochstrasser (1996). «From Proteins to Proteomes: Large Scale Protein Identification by Two-Dimensional Electrophoresis and Arnino Acid Analysis». Nature Biotechnology 14 (1):  pp. 61–65. doi:10.1038/nbt0196-61. PMID 9636313. 
  5. UNSW Staff Bio: Professor Marc Wilkins
  6. Hanash SM, Pitteri SJ, Faca VM. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers. Nature. 2008 Apr 3;452(7187):571-9. Review. PubMed PMID: 18385731.
  7. Weiss W, Görg A. High-resolution two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 2009;564:13-32. PubMed PMID: 19544015.
  8. Keren H, Lev-Maor G, Ast G. Alternative splicing and evolution: diversification, exon definition and function. Nat Rev Genet. 2010 May;11(5):345-55. Epub 2010 Apr 8. Review. PubMed PMID: 20376054.
  9. Simon Rogers, Mark Girolami, Walter Kolch, Katrina M. Waters, Tao Liu, Brian Thrall and H. Steven Wiley (2008). «Investigating the correspondence between transcriptomic and proteomic expression profiles using coupled cluster models». Bioinformatics 24 (24):  pp. 2894–2900. doi:10.1093/bioinformatics/btn553. PMID 18974169. 
  10. Vikas Dhingraa, Mukta Gupta, Tracy Andacht and Zhen F. Fu (2005). «New frontiers in proteomics research: A perspective». International Journal of Pharmaceutics 299 (1–2):  pp. 1–18. doi:10.1016/j.ijpharm.2005.04.010. PMID 15979831. 
  11. Buckingham, Steven (Mayo de 2003). «The major world of microRNAs». Consultado el 14 de enero de 2009.
  12. Picotti P, Bodenmiller B, Mueller LN, Domon B, Aebersold R. Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targeted proteomics. Cell. 2009 Aug 21;138(4):795-806.
  13. Wilm M. Quantitative proteomics in biological research. Proteomics. 2009 Oct;9(20):4590-605.

Enlaces externos[editar]

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