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La fundación de Guayaquil fue un proceso de conquista española en la actual región litoral de Ecuador, con lo cual, después de varios traslados y conflictos con pobladores nativos, quedó definitivamente fundada la ciudad bajo el título de Muy Noble y Muy Leal Ciudad de Santiago de Guayaquil.
Entre las causas de la conquista de la región estaba la expansión española por parte de Francisco Pizarro hacia el norte del Perú y su afán de marcar límites para sus territorios conquistados. Además se decidió apresurar las fundaciones de una ciudad y dos villas para prevenir y evitar los afanes expansionistas de Pedro de Alvarado desde América Central.
El 15 de agosto de 1534, Diego de Almagro, ante la amenaza de Pedro de Alvarado, asistido por Sebastián de Benalcázar se vio obligado a fundar en Liribamba la ciudad de Santiago de Quito. Trece días más tarde, el 28, por las mismas razones y en el mismo lugar que Santiago, fundó la villa de San Francisco de Quito. La Real Cédula del 4 de mayo de 1534, establecía que, toda fundación debía reunir las condiciones requeridas por la conquista. Caso contrario, recomendaba su traslado a otro lugar que sí las cumpliese. Esto ocurrió en ambos caos: San Francisco fue trasladada al lugar en que hoy de halla dentro del territorio de Quito, el 6 de diciembre de 1534 y mantuvo así el topónimo.
Después de ser fundada la ciudad a orillas del río Amay, actual río Babahoyo, por Sebastián de Belalcázar en 1535, la ciudad fue traslada por Hernando de Zaera hasta otro sector denominado como "Yagual" en agosto de 1536. Pero poco después, debido a hostilidades de los nativos, varios pobladores decidieron abandonar el poblado. Pizarro le encargó al capitán Francisco de Orellana que traslade nuevamente la ciudad, y en efecto lo hizo, ubicándola cerca de la desembocadura del río Yaguachi, bajo el nombre de "Santiago de la Nueva Castilla". Poco después el capitán Orellana partío hacia la Ciudad de los Reyes dejando a Diego de Urbina al mando de la ciudad. Nuevamente aparecieron los enfrentamiento con los nativos, razón por la cual Urbina decide trasladar la ciudad cerca de los huancavilcas, a quienes se les suponiá que eran nativos pacíficos, pero en 1543 tiene que otra vez trasladarla hacia el poblado fundado anteriormente por Belalcázar.
Poco después de la fundación de Santiago de Guayaquil, se desata una guerra civil entre los Almagro y los Pizarro, y el capitán Francisco de Olmos dominó la ciudad mientras duró el conflicto en el Perú. Pero después de la muerte de Diego de Almagro y la victoria de Francisco Pizarro, Olmos decide trasladar la ciudad al otro lado del río Guayas y fundarla definitivamente en el cerro Santa Ana en 1547.
