Diferencia entre revisiones de «ARN CRISPR transactivante (ARNtracr)»

De Wikipedia, la enciclopedia libre
Explorar historial interactivamente
← Ir a diferencia anteriorIr a siguiente diferencia →
Contenido eliminado Contenido añadido
VisualWikitexto
Línea 56: Línea 56:


A continuación, en la etapa de expresión, la matriz CRISPR se transcribe dando lugar a un largo transcrito primario, ARN precursor-CRISPR (pre-crRNA), molécula larga de ARN que contiene todos los espaciadores adquiridos en la etapa anterior separados por secuencias repetidoras. <ref>{{Cita web|url=http://www.medisur.sld.cu/index.php/medisur/article/view/5279/3643|título=Principles and medical applications of gene editing by CRISPR /
A continuación, en la etapa de expresión, la matriz CRISPR se transcribe dando lugar a un largo transcrito primario, ARN precursor-CRISPR (pre-crRNA), molécula larga de ARN que contiene todos los espaciadores adquiridos en la etapa anterior separados por secuencias repetidoras. <ref>{{Cita web|url=http://www.medisur.sld.cu/index.php/medisur/article/view/5279/3643|título=Principles and medical applications of gene editing by CRISPR /
Cas}}</ref> <ref>{{Cita publicación|url=http://dx.doi.org/10.1002/bmb.21108|título=Molecular biology at the cutting edge: A review on CRISPR/CAS9 gene editing for undergraduates|apellidos=Thurtle-Schmidt|nombre=Deborah M.|apellidos2=Lo|nombre2=Te-Wen|fecha=2018-01-30|publicación=Biochemistry and Molecular Biology Education|volumen=46|número=2|páginas=195–205|fechaacceso=2022-10-29|issn=1470-8175|doi=10.1002/bmb.21108}}</ref>También se transcribe un segundo RNA procedente de un locus genómico situado aguas arriba del locus CRISPR y de los genes cas; el tracrRNA. <ref>{{Cita libro|título=CRISPR/Cas System: An Introduction|url=http://dx.doi.org/10.1007/978-981-15-7142-8_1|editorial=Springer Singapore|fecha=2021|fechaacceso=2022-10-29|isbn=978-981-15-7141-1|páginas=1–35|nombre=Nayla|apellidos=Munawar|nombre2=Aftab|apellidos2=Ahmad}}</ref><ref>{{Cita publicación|url=http://dx.doi.org/10.1186/s12929-018-0425-5|título=CRISPR/Cas9: the Jedi against the dark empire of diseases|apellidos=Khan|nombre=Sehrish|apellidos2=Mahmood|nombre2=Muhammad Shahid|fecha=2018-03-28|publicación=Journal of Biomedical Science|volumen=25|número=1|fechaacceso=2022-10-29|issn=1423-0127|doi=10.1186/s12929-018-0425-5|apellidos3=Rahman|nombre3=Sajjad ur|apellidos4=Zafar|nombre4=Hassan|apellidos5=Habibullah|nombre5=Sultan|apellidos6=khan|nombre6=Zulqarnain|apellidos7=Ahmad|nombre7=Aftab}}</ref>
Cas}}</ref>Dicho pre-crRNA presenta el locus tracrRNA de manera que se transcribe el tracrRNA procedente de un locus genómico situado aguas arriba de los genes cas y del locus CRISPR.


Ambos ARNs (pre-crRNA y tracrRNA) se hibridan debido a su complementariedad de bases de la secuencia repetida y complementaria al locus CRISPR formando un complejo dúplex reconocido y posteriormente escindido por la RNAsa III quien va a llevar a cabo el procesamiento generando el extremo 3′ de los ARNcr maduros. Se tratan de secuencias de ARN constituidas por un único espaciador (secuencia corta variable de ARN, homóloga a las secuencias genómicas de fagos/acido nucleico extraño) en su extremo 5’ flanqueada por dos secuencias repetidoras. Sin embargo, queda por establecer si otras nucleasas celulares contribuyen al procesamiento del extremo 5′ del crRNA en los sistemas de tipo II para que el crRNA intermediario se transfigure en su estructura madura. De esta manera, el crRNA originalmente con dos secuencias repetidoras pasa a tener exclusivamente una, facilitando así su afinidad y unión al tracrRNA y consecuentemente, la guía al ADN invasor para degradarlo. Por otro lado, la RNasa III no es necesaria para el procesamiento de un transcrito de crRNA "mínimo" que incluye un único espaciador. TracrRNA, por lo tanto, dirige la maduración de precr-RNA promoviendo la escisión endonucleotídica dando lugar a ARNcr.
Ambos ARNs (pre-crRNA y tracrRNA) se hibridan debido a su complementariedad de bases de la secuencia repetida y complementaria al locus CRISPR formando un complejo dúplex reconocido y posteriormente escindido por la RNAsa III quien va a llevar a cabo el procesamiento generando el extremo 3′ de los ARNcr maduros. Se tratan de secuencias de ARN constituidas por un único espaciador (secuencia corta variable de ARN, homóloga a las secuencias genómicas de fagos/acido nucleico extraño) en su extremo 5’ flanqueada por dos secuencias repetidoras. Sin embargo, queda por establecer si otras nucleasas celulares contribuyen al procesamiento del extremo 5′ del crRNA en los sistemas de tipo II para que el crRNA intermediario se transfigure en su estructura madura. De esta manera, el crRNA originalmente con dos secuencias repetidoras pasa a tener exclusivamente una, facilitando así su afinidad y unión al tracrRNA y consecuentemente, la guía al ADN invasor para degradarlo. Por otro lado, la RNasa III no es necesaria para el procesamiento de un transcrito de crRNA "mínimo" que incluye un único espaciador. TracrRNA, por lo tanto, dirige la maduración de precr-RNA promoviendo la escisión endonucleotídica dando lugar a ARNcr.
Línea 62: Línea 62:
Seguidamente, el híbrido crRNA:tracrRNA se asocia con una proteína Cas9, creando un complejo de [[ribonucleoproteína]] activo (RNP). Aún así, queda por establecer si la contribución de Cas9 se debe al papel activo en el reconocimiento de crRNA y tracrRNA, o a la capacidad de eliminar estructuras secundarias en las moléculas de crRNA y tracrRNA monocatenarias. Cabe destacar que el extremo 3 'de tracrRNA puede contribuir a la unión de Cas9, demostrando una vez más su importància en los sistemes CRISPR del tipo II.
Seguidamente, el híbrido crRNA:tracrRNA se asocia con una proteína Cas9, creando un complejo de [[ribonucleoproteína]] activo (RNP). Aún así, queda por establecer si la contribución de Cas9 se debe al papel activo en el reconocimiento de crRNA y tracrRNA, o a la capacidad de eliminar estructuras secundarias en las moléculas de crRNA y tracrRNA monocatenarias. Cabe destacar que el extremo 3 'de tracrRNA puede contribuir a la unión de Cas9, demostrando una vez más su importància en los sistemes CRISPR del tipo II.


Evidencias experimentales tanto in vitro como in vivo demuestran que este ARN dual que dirige a Cas9 para escindir cualquier ADN debe de contener al menos 15 nt más allá de la secuencia complementaria de crRNA y PAM adyacente. Así entonces, el recorte en el extremo 3' de tracrRNA compromete la actividad de escisión del ADN, lo que sugiere que el fragmento de tracrRNA cerca de la unión dúplex puede ser crítico para la interacción con la proteína Cas9.<ref>{{Cita publicación|url=http://dx.doi.org/10.4161/rna.24203|título=crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in<i>Streptococcus thermophilus</i>|apellidos=Karvelis|nombre=Tautvydas|apellidos2=Gasiunas|nombre2=Giedrius|fecha=2013-03-27|publicación=RNA Biology|volumen=10|número=5|páginas=841–851|fechaacceso=2022-10-29|issn=1547-6286|doi=10.4161/rna.24203|apellidos3=Miksys|nombre3=Algirdas|apellidos4=Barrangou|nombre4=Rodolphe|apellidos5=Horvath|nombre5=Philippe|apellidos6=Siksnys|nombre6=Virginijus}}</ref> para el ensamblaje del complejo catalíticamente activo
Evidencias experimentales tanto in vitro como in vivo demuestran que este ARN dual que dirige a Cas9 para escindir cualquier ADN debe de contener al menos 15 nt más allá de la secuencia complementaria de crRNA y PAM adyacente. Así entonces, el recorte en el extremo 3' de tracrRNA compromete la actividad de escisión del ADN, lo que sugiere que el fragmento de tracrRNA cerca de la unión dúplex puede ser crítico para la interacción con la proteína Cas9.<ref>{{Cita publicación|url=http://dx.doi.org/10.4161/rna.24203|título=crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in<i>Streptococcus thermophilus</i>|apellidos=Karvelis|nombre=Tautvydas|apellidos2=Gasiunas|nombre2=Giedrius|fecha=2013-03-27|publicación=RNA Biology|volumen=10|número=5|páginas=841–851|fechaacceso=2022-10-29|issn=1547-6286|doi=10.4161/rna.24203|apellidos3=Miksys|nombre3=Algirdas|apellidos4=Barrangou|nombre4=Rodolphe|apellidos5=Horvath|nombre5=Philippe|apellidos6=Siksnys|nombre6=Virginijus}}</ref> para el ensamblaje del complejo catalíticamente activo.


La etapa de interferencia tiene lugar cuando el genoma de un organismo foráneo reincidente intenta de nuevo infectar la célula. En este estadio, el híbrido de RNA (tracrRNA:crRNA), es imprescindible para dirigir a la endonucleasa Cas9 hacia la secuencia diana del material genómico invasivo que debe degradar. <ref>{{Cita web|url=http://dx.doi.org/10.3410/f.717951303.793456603|título=Faculty Opinions recommendation of A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.|fechaacceso=2022-10-28|apellido=Pingoud|nombre=Alfred|fecha=2012-07-26|sitioweb=Faculty Opinions – Post-Publication Peer Review of the Biomedical Literature}}</ref><ref>{{Cita libro|título=A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity|url=http://worldcat.org/oclc/1233892747|editorial=Umeå universitet, Molekylär Infektionsmedicin, Sverige (MIMS)|fecha=2012|fechaacceso=2022-10-28|oclc=1233892747|nombre=Jinek, Martin Chylinski, Krzysztof Fonfara, Ines Hauer, Michael Doudna, Jennifer A Charpentier,|apellidos=Emmanuelle}}</ref>Para que se produzca la lucha entre Cas9 y el elemento genético invasor deben cumplirse dos requisitos indispensables: que exista hibridación mediada por complementariedad de bases (A=T, G≡C) entre el crRNA y la diana; y que la secuencia diana a cortar se localice inmediatamente adyacente a un PAM (Protospacer Adjacent Motif), una secuencia de unos pocos nucleótidos, con una composición de bases y tamaño que varía entre sistemas CRISPR/Cas (por ejemplo, para Cas9 de Streptococcus pyogenes -SpCas9- esta secuencia es 5´NGG3´; El híbrido de RNA utiliza la secuencia PAM específica aguas arriba o aguas abajo del protoespaciador, mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick.
La etapa de interferencia tiene lugar cuando el genoma de un organismo foráneo reincidente intenta de nuevo infectar la célula procariota. En este estadio, el híbrido de RNA (tracrRNA:crRNA), es imprescindible para dirigir a la endonucleasa Cas9 hacia la secuencia diana del material genómico invasivo que debe degradar. <ref>{{Cita web|url=http://dx.doi.org/10.3410/f.717951303.793456603|título=Faculty Opinions recommendation of A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.|fechaacceso=2022-10-28|apellido=Pingoud|nombre=Alfred|fecha=2012-07-26|sitioweb=Faculty Opinions – Post-Publication Peer Review of the Biomedical Literature}}</ref><ref>{{Cita libro|título=A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity|url=http://worldcat.org/oclc/1233892747|editorial=Umeå universitet, Molekylär Infektionsmedicin, Sverige (MIMS)|fecha=2012|fechaacceso=2022-10-28|oclc=1233892747|nombre=Jinek, Martin Chylinski, Krzysztof Fonfara, Ines Hauer, Michael Doudna, Jennifer A Charpentier,|apellidos=Emmanuelle}}</ref>Para que se produzca la lucha entre Cas9 y el elemento genético invasor deben cumplirse dos requisitos indispensables: que exista hibridación mediada por complementariedad de bases (A=T, G≡C) entre el crRNA y la diana; y que la secuencia diana a cortar se localice inmediatamente adyacente a un PAM (Protospacer Adjacent Motif), una secuencia de unos pocos nucleótidos, con una composición de bases y tamaño que varía entre sistemas CRISPR/Cas (por ejemplo, para Cas9 de Streptococcus pyogenes -SpCas9- esta secuencia es 5´NGG3´; El híbrido de RNA utiliza la secuencia PAM específica aguas arriba o aguas abajo del protoespaciador, mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick.


==Historia y antecedentes==
==Historia y antecedentes==

Revisión del 11:03 29 oct 2022


El ARN CRISPR transactivante o ARNtracr, es un fragmento de ARN que interactúa con el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR). De CRISPR hay muchos tipos, pero nos centraremos en el tipo 2, en el que el tracrRNA usa una secuencia complementaria a este de manera que se permite la maduración del ARNcr con la ayuda del Cas9. El CRISPR proporciona inmunidad adaptiva a bacterias, arqueas y bacteriófagos (Qué?) y el uso de la tecnología con este sistema está siendo muy útil para la edición del genoma. A continuación hablaremos de la clasificación.

Biosíntesis y genética

Esta imagen muestra cómo se sintetiza el ARNtracr en un sistema CRISPR/Cas9 Tipo II-A (FIGURA 1)

Procedimiento (Figura 1)

Adaptación

El bacteriófago se une a la membrana plasmática de una bacteria (p. ej.:Streptococcus pyogenes) e introduce su material genético o ADN bicatenario al citoplasma celular. Esto conlleva toda una serie de transducción de señales que activan las RNasas (Nucleasas) Cas1 y Cas2[1]​, y detectan una secuencia de nucleótidos específica del ADN vírico bicatenario, también conocido como protoespaciador, gracias a una secuencia PAM (Protospacer adjacent motif) que la precede.

Tras la localización de esta secuencia específica, las RNasas Cas1 y Cas2 llevan a cabo el proceso de integración del material genético vírico al ADN bicatenario de la bacteria (Este proceso también es conocido como fase de adaptación[2]​[3]​[4]​). Esta secuencia se convierte en un espaciador característico del virus en el ADN bacteriano con una secuencia CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) adyacente. El conjunto de espaciadores y secuencias CRISPR que se encuentran en el genoma procariota se denomina matriz CRISPR.

Esta matriz CRISPR, en el caso de la bacteria Streptococcus pyogenes, como se trata de un sistema Tipo II-A, estarà formada por cinco espaciadores cuyos objetivos serán la endopeptidasa, el superantígeno (speM), la metiltransferasa, la hialuronidasa y una proteína hipotética del fago o bacteriófago[4]​. Le sigue, aguas arriba (en sentido 5'), una secuencia líder rica en secuencia AT[5]​ (Adenina y Timina) que delimita el inicio de la matriz y la separa del operón Cas; formado por los genes codificantes de las proteínas (nucleasas) Cas9, Cas1, Cas2 y Csn2[6]​. Seguidamente, se encuentra la secuencia del promotor de transcripción y, finalmente, el gen codificante del ARNtracr; subdividido en una región que codifica para el ARNtracr largo o tracr-L, y en otra que codifica para el ARNtracr corto o tracr-S.

Expresión

Ante la falta de investigación sobre este mecanismo, aún no data un sistema de transcripción concreto que determine qué inicia la biosíntesis del ARNtracr. No obstante, se ha tratado de demostrar la coexistencia de dos tipos de sistemas que pueden llevar a cabo la biosíntesis del ARNtracr.

Por un lado, según un estudio basado en la constante observación de la expresión y el procesamiento de los ARNtracr, a raíz de un sondeo de ARN de varias bacterias (Neisseria meningitidis, Streptococcus mutans y Streptococcus thermophilus), se determinó que los respectivos sistemas CRISPR/Cas9 de tipo II se encuentran constitutivamente activos. Como consecuencia, las bacterias que gozan de este sistema presentan una alta respuesta inmunológica ante bacteriófagos que las infecte[7]​.

No obstante, por otro lado, sí que existen otros tipos de bacterias dotadas de un represor del promotor de transcripción del locus CRISPR. Este sistema es llevado a cabo por un tipo de ARNtracr salvaje de algunas bacterias (ARNtracr largo o tracr-L) que se pliega en forma de ARNg[3]​ y se une a una proteína Cas9[7]​. Este, al encontrarse libre, mediante la complementariedad de bases nitrogenadas de una pequeña región de la molécula respecto a una corta secuencia PAM del promotor de transcripción, se une al locus CRISPR y silencia la transcripción (silenciamiento génico transcripcional o TGS) del locus. Por esta misma razón, el tracr-L es capaz de regular la síntesis de las proteínas Cas y del resto de genes del locus[3]​. De este modo, cuando una célula, en este caso Streptococcus pyogenes, es infectada por un bacteriófago, el represor transcripcional (tracr-L) se libera y permite la activación del promotor para iniciar la transcripción del locus CRISPR. Por esta misma razón, a diferencia del sistema constitutivo de algunas bacterias, la importancia del tracr-L radica en la significativa reducción de probabilidades de padecer enfermedades autoinmunitarias.

Tal y como se representa en la FIGURA 1, la transcripción del operón Cas9 y la matriz CRISPR va en sentido 5'-3', es decir, que la síntesis de ARN es 3'-5'; mientras que la transcripción del gen ARNtracr, que finaliza gracias a la presencia de una Terminación independiente de Rho, es 3'-5', de manera que la biosíntesis del ARNtracr será 5'-3' (en excepción de un gen ARNtracr del sistema CRISPR/Cas9 Tipo II-C)[8]​.

Como resultado de la transcripción y expresión de genes, se sintetizan un conjunto de ARN's y proteínas que desarrollan la respuesta inmunológica, como ahora el tracr-P (tracr-S procesado o transcrito), las RNasas Cas9, Cas1, Cas2 y Csn2 y el pre-ARNcr (pre-ARN CRISPR).

Localizaciones del gen ARNtracr

Como se ha especificado anteriormente, este caso se centra en el sistema CRISPR/Cas9 Tipo II-A del Streptococcus pyogenes. El estudio de los diferentes sistemas CRISPR ha conllevado la aparición de una gran diversidad de sistemas de respuesta inmunitaria de las diferentes bacterias dotadas del sistema CRISPR/Cas9. Por ende, se presenta una gran la variabilidad de los genes codificantes[8]​[9]​. En otros sistemas CRISPR/Cas Tipo II, como el Tipo II-A del S. thermophilus, el gen codificante del ARNtracr tanto se encuentra aguas arriba del gen Cas9 como justo después de su secuencia. En el caso del Tipo II-B del Francisella Novicida, el gen se encuentra adyacente al operón Cas9 y aguas arriba de la matriz CRISPR[10]​. O, en el caso del Tipo II-C del Campylobacter jejuni, que la localización de sus genes ARNtracr se basa en la unión de los modelos de los Tipos II-A y II-B.

Estructura y composición química

Simplificación de la estructura secundaria de ARN guía (modelo base)

El tracrARN es un pequeño ARN no codificante formado por entre 50 y 171 nucleótidos, por lo que tiene un masa molar de entre 16500-49500 dalton. El número de nucleótidos puede variar tras la maduración del crARN (transcrito del gen CRISPR) en la que interviene, ya que puede ser escindido por la RNAsa III la cual regula la maduración del transcrito.[11]​

En cuanto a su composición química, el tracrARN, está formado por la polimerización de nucleótidos mediante la combinación de las bases nitrogenadas A-U, G-C. Se ha establecido un modelo, llamado andamio (scaffold), que establece las bases nitrogenadas que tiene el tracrARN, aunque puede contener otras dependiendo de la familia de la bacteria. [12]​

El modelo base de unión al crARN es el siguiente:

5´AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUCG-3’ [13]​[7]​

Alrededor de los primeros 24-25 nucleótidos corresponden a la secuencia de anterrepetición parcialmente complementaria a la secuencia repetidora del crARN, a la que se une formando un ARN híbrido conocido como ARN guía o gARN que se une a la proteína Cas9 para dirigirla hasta el ADN vírico ambas cadenas son necesarias para llevar a cabo esta acción.[7]​[14]​

La estructura del tracrARN está definida por 3 loops. En el primer loop se encuentra la secuencia de anterrepetición y el linker de unión al siguiente tramo. Esta zona presenta gran afinidad por la proteína Cas9, en concreto por la dominio Hel-I, rica en arginina, y el dominio CTD. El segundo loop mantiene muchos menos contacto con la proteína y tan solo presenta cierta afinidad por los dominios RuvC y CTD. Por último, en el tercer loop no se ha encontrado ningún tipo de unión con la proteína porque para observar su estructura por cristalografía se ha de prescindir de este.[7]​ En una visión global, se observa, por tanto, que el gARN se encuentra entre los dos lóbulos de la proteína Cas9.[15]​

ARN guía unido a Cas 9 y asociado con el fragmento de ADN diana
ARN guía unido a Cas 9 y asociado con el fragmento de ADN diana

Funciones

El tracrARN media la interacción entre crRNA y Cas9, endonucelasa asociada a los sistemas CRISPR del tipo II, convirtiéndose así en uno de los componentes esenciales en el sistema inmunitario procariota. El sistema CRISPR II es el que se ha utilizado mayormente como herramienta de edición genética por su simple mecanismo en el cual participan tres componentes siendo el tracrRNA uno principal de ellos junto con la proteïna Cas 9 y el crRNA. La nucleasa Cas9 utiliza como guía a un crRNA que se aparea con el ARN transactivador, el cual cumple una función principalmente estructural.[16]​

Esta funcion esencial involucrada en la conformación de la estruuctura del complejo CRISPR se puede desglogar en tres funciones principales; participa en la adquisición del espaciador, dirige la maduración de otro ARN no codificante (pre-crRNA) mediante la actividad de la enzima RNAasa III para produir la especie activa (crRNAs maduros). Y, por otro lado, tracrRNA también es necesario para que la nucleasa Cas9 realice el corte en el ADN diana proveniente del material genético del virus (bacteriófago) inactivandólo y protegiendo a la célula procariota de agentes patógenos invasores.[17]​

Mecanismos de reacción y rutas

En general, el funcionamiento del sistema CRISPR que proporciona la inmunidad adquirida en bacterias y arqueas, se puede dividir en tres etapas bien diferenciadas: etapa de adquisición, etapa de expresión y etapa de interferencia. Cada uno de los diferentes tipos de sistema CRISPR presenta peculiaridades propias de su biología, pero la ruta de maduración y procesamiento de crRNA en los sistemas de tipo II, como lo ejemplifica S. pyogenes , difiere significativamente. Se ha demostrado que el proceso requiere una molécula de tracrRNA adicional y depende de la RNasa III de la célula huésped. [18]​

Durante la etapa de adquisición en la que se ha captado DNA foráneo del ente invasor (protoespaciador) y se ha incorporado en el locus CRISPR (espaciador) entre las secuencias repetidas y en posición 5´ respecto a la secuencia espaciadora y siempre tras la secuencia líder, el tracrRNA parece estar involucrado en la adquisición del espaciador guiado por la Cas 9, aunque la base mecánica de esta función sigue siendo difícil de alcanzar. [19]​

A continuación, en la etapa de expresión, la matriz CRISPR se transcribe dando lugar a un largo transcrito primario, ARN precursor-CRISPR (pre-crRNA), molécula larga de ARN que contiene todos los espaciadores adquiridos en la etapa anterior separados por secuencias repetidoras. [20]​ [21]​También se transcribe un segundo RNA procedente de un locus genómico situado aguas arriba del locus CRISPR y de los genes cas; el tracrRNA. [22]​[23]​

Ambos ARNs (pre-crRNA y tracrRNA) se hibridan debido a su complementariedad de bases de la secuencia repetida y complementaria al locus CRISPR formando un complejo dúplex reconocido y posteriormente escindido por la RNAsa III quien va a llevar a cabo el procesamiento generando el extremo 3′ de los ARNcr maduros. Se tratan de secuencias de ARN constituidas por un único espaciador (secuencia corta variable de ARN, homóloga a las secuencias genómicas de fagos/acido nucleico extraño) en su extremo 5’ flanqueada por dos secuencias repetidoras. Sin embargo, queda por establecer si otras nucleasas celulares contribuyen al procesamiento del extremo 5′ del crRNA en los sistemas de tipo II para que el crRNA intermediario se transfigure en su estructura madura. De esta manera, el crRNA originalmente con dos secuencias repetidoras pasa a tener exclusivamente una, facilitando así su afinidad y unión al tracrRNA y consecuentemente, la guía al ADN invasor para degradarlo. Por otro lado, la RNasa III no es necesaria para el procesamiento de un transcrito de crRNA "mínimo" que incluye un único espaciador. TracrRNA, por lo tanto, dirige la maduración de precr-RNA promoviendo la escisión endonucleotídica dando lugar a ARNcr.

Seguidamente, el híbrido crRNA:tracrRNA se asocia con una proteína Cas9, creando un complejo de ribonucleoproteína activo (RNP). Aún así, queda por establecer si la contribución de Cas9 se debe al papel activo en el reconocimiento de crRNA y tracrRNA, o a la capacidad de eliminar estructuras secundarias en las moléculas de crRNA y tracrRNA monocatenarias. Cabe destacar que el extremo 3 'de tracrRNA puede contribuir a la unión de Cas9, demostrando una vez más su importància en los sistemes CRISPR del tipo II.

Evidencias experimentales tanto in vitro como in vivo demuestran que este ARN dual que dirige a Cas9 para escindir cualquier ADN debe de contener al menos 15 nt más allá de la secuencia complementaria de crRNA y PAM adyacente. Así entonces, el recorte en el extremo 3' de tracrRNA compromete la actividad de escisión del ADN, lo que sugiere que el fragmento de tracrRNA cerca de la unión dúplex puede ser crítico para la interacción con la proteína Cas9.[24]​ para el ensamblaje del complejo catalíticamente activo.

La etapa de interferencia tiene lugar cuando el genoma de un organismo foráneo reincidente intenta de nuevo infectar la célula procariota. En este estadio, el híbrido de RNA (tracrRNA:crRNA), es imprescindible para dirigir a la endonucleasa Cas9 hacia la secuencia diana del material genómico invasivo que debe degradar. [25]​[26]​Para que se produzca la lucha entre Cas9 y el elemento genético invasor deben cumplirse dos requisitos indispensables: que exista hibridación mediada por complementariedad de bases (A=T, G≡C) entre el crRNA y la diana; y que la secuencia diana a cortar se localice inmediatamente adyacente a un PAM (Protospacer Adjacent Motif), una secuencia de unos pocos nucleótidos, con una composición de bases y tamaño que varía entre sistemas CRISPR/Cas (por ejemplo, para Cas9 de Streptococcus pyogenes -SpCas9- esta secuencia es 5´NGG3´; El híbrido de RNA utiliza la secuencia PAM específica aguas arriba o aguas abajo del protoespaciador, mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick.

Historia y antecedentes

La historia del tracrARN forma parte de la historia del CRISPR. Este fue descubierto por Francisco Mojica en 1992 al observar una repetición de bases en el genoma de la arquea Haloferax mediterranei. En un primer momento, Mojica, no pudo descifrar a que se debían estas repeticiones y no fue hasta el año 2003 cuando el científico dilucidó que estas se debían al sistema inmunitario del microorganismo y que estaba presente en todas las bacterias.

Tras este descubrimiento, muchos científicos analizaron diferentes familias de bacteria observando distintos tipos de CRISPR. A grandes rasgos encontramos tres tipos I,II,II. El tracrARN, tan solo se encuentra en el tipo II. Esta molécula fue descubierta por Emmanuelle Marie Charpentier en colaboración con Jörg Vogel del Grupo de Biología del RNA en el Instituto de Biología Molecular de la Infección en la Universidad de Würzburg, en Würzburg, Alemania,  en un estudio que trataba de identificar ARNs microbianos, tras observar uno especialmente virulento en el Streptococcus pyogenes, para ello utilizó un programa bioinformático que buscaba regiones intergénicas que pudieran regular funciones de la bacteria y que no codificaban para ninguna proteína. En su estudio, observó una región cerca del CRISPR que podría llevar esto a cabo. Tras observarla más detenidamente, pudo ver que se trataba del tercer arn no codificante más abundante y que su función era participar en la maduración del crARN y su combinación con este hace que tan solo se necesite una proteína, la Cas 9, para llevar a cabo la acción inmunitaria de la bacteria. Fue denominado tracrARN.

En 2011, Charpentier presentó su descubrimiento en una conferencia. Allí conoció a Jennifer Doudna, bióloga estadounidense, quien junto a Charpentier ideó el método CRISPR-Cas9 para insertar genes en el genoma de seres vivos, reprogramando el crARN para que fuera específico al segmento que se quería cortar, y crearon una quimera fusionando las cadenas de crARN y tracrARN (sgARN).

Debido a sus descubrimientos, a ambas científicas se les otorgó el premio nobel de química 2020. [27]​[28]​[29]​[30]​[31]​

Aplicaciones

El tracrRNA interactuando con el CRISPR adaptado es una herramienta biotecnológica de gran potencia. Sus utilidades destacan sobre todo en el campo de la edición genética y diagnóstico molecular. Además de poseer una gran concisión y simplicidad en su diseño tiene un coste bajo lo cual permite que sea muy usado en la investigación y edición. Algunas de las aplicaciones serían:

  • Diagnóstico molecular

Gracias a que se puede utilizar para reconocer ácidos nucleicos, se pueden detectar mutaciones en los nucleótidos porque se detectaría la diferencia entre el sistema CRISPR y la secuencia diana gracias a su elevado grado de especificidad. Asimismo, sería posible la detección de patógenos cuando están infectando a través del análisis de su material genético (ARN o ADN) y se podrían diagnosticar enfermedades que tienen sitio a nivel molecular con mayor exactitud y seguridad como sería el caso del cáncer.

  • Sistema LEOPARD ( "Leveraging Engineered tracrRNAs and On-target DNAs for PArallel RNA Detection") para el tratamiento de la COVID-19

Un ejemplo sería el sistema LEOPARD que, debido a la situación actual ha cobrado mucha importancia. Mediante el uso de los ARNtracr y el ADN, el ARN paralelo es detectado. Está programado para que cuando se detecte cualquier ARN, el ADN correspondiente sea cortado por Cas9. De esta manera, este método de diagnóstico CRISPR permite detectar múltiples biomarcadores al mismo tiempo. Es este método el que distinguió el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) y su variante D614G. En resumen, el tracrRNA es reprogramado para decidir los ARN que serán los ARN guía y dependiendo de qué ADN corta se puede determinar los ARN que estaban presentes en la muestra.

  • Bloqueo de la expresión del gen VIH1

De cara al futuro, también es un método muy esperanzador para enfermedades para las que no se ha encontrado aún una cura definitiva, como es el caso del VIH. Ya que, a pesar de haber desarrollado terapias para hacer que la replicación del virus VIH-1 permanezca controlada, el virus no desaparece sino que se mantiene en un estado de latencia en el genoma de la célula huésped. Consecuentemente, continúa presente la amenaza de que al cabo de un tiempo resurja. La solución que se ofrece con el CRISPR/Cas9 es que este, potencialmente, modificar el genoma del VIH-1 así como impedir su expresión.

Se ha puesto a prueba la capacidad del CRISPR/Cas9 para anular la expresión del virus VIH-1 editando el ADN proviral integrado. Se dirigen los componentes CRISPR/Cas9 hacia el LTR, que son secuencias terminales genéticas de su genoma que regulan la integración del ácido nucleico viral en los cromosomas de la célula huésped y por lo tanto influyen en la virulencia de este, y se consiguió inhibir de forma importante la expresión del virus mediada por LTR y también suprimir provirus del genoma celular.

Ensayos clínicos

  • Cáncer

Se está trabajando en un ensayo clínico llevado a la práctica por ___ con el objetivo de mejorar la capacidad de las células T humanas para combatir el cáncer. Está basado en quitar dos de los genes que codifican las cadenas del receptor endógeno de las células T (TCR), que son el TCRα y TCRβ, para así reducir al máximo el emparejamiento equívoco de TCR y así conseguir un de esta manera lograr una mejor expresión de un transgen TCR sintético específico para el cáncer. Asimismo, se eliminó otro gen que codificaba la proteína de muerte celular programada con el fin de aumentar la inmunidad antitumoral. La transferencia de estas células T modificadas genéticamente a los pacientes con cáncer permitió conseguir en un injerto duradero con ediciones en los tres loci genómicos. Estas células T modificadas persistieron durante un periodo de hasta 9 meses, cosa que propone que la inmunogenicidad es mínima en estas condiciones y evidencia la viabilidad de la edición del gen CRISPR para la inmunoterapia contra el cáncer.

Referencias

  1. ↑ Rocha, Taibo; Eugenia, María (2016). Caracterización y análisis de la variación de Loci CRISPRs en Streptococcus thermophilus. Consultado el 21 de octubre de 2022. 
  2. ↑ Vol. 25 (2022). doi:10.22201/fesz.23958723e.2022. Consultado el 23 de octubre de 2022. 
  3. ↑ a b c «Shibboleth Authentication Request». login.sire.ub.edu. doi:10.1146/annurev-genet-071719-022559. Consultado el 23 de octubre de 2022. 
  4. ↑ a b «Shibboleth Authentication Request». login.sire.ub.edu. doi:10.1080/15476286.2019.1582974?needaccess=true. Consultado el 21 de octubre de 2022. 
  5. ↑ «ORIGEN Y DESARROLLO DEL SISTEMA CRISPR/Cas. De 1987 a 2002. 1ª parte». www.fernandogalangalan.com. Consultado el 21 de octubre de 2022. 
  6. ↑ «Shibboleth Authentication Request». login.sire.ub.edu. doi:10.1038/471588a. Consultado el 23 de octubre de 2022. 
  7. ↑ a b c d e Deltcheva, Elitza; Chylinski, Krzysztof; Sharma, Cynthia M.; Gonzales, Karine; Chao, Yanjie; Pirzada, Zaid A.; Eckert, Maria R.; Vogel, Jörg et al. (31 de marzo de 2011). «CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III». Nature 471 (7340): 602-607. ISSN 0028-0836. PMC 3070239. PMID 21455174. doi:10.1038/nature09886. Consultado el 21 de octubre de 2022. 
  8. ↑ a b Karvelis, Tautvydas; Gasiunas, Giedrius; Miksys, Algirdas; Barrangou, Rodolphe; Horvath, Philippe; Siksnys, Virginijus (1 de mayo de 2013). «crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus». RNA Biology 10 (5): 841-851. ISSN 1547-6286. PMC 3737341. PMID 23535272. doi:10.4161/rna.24203. Consultado el 23 de octubre de 2022. 
  9. ↑ Liao, Chunyu; Beisel, Chase L. (23 de noviembre de 2021). «The tracrRNA in CRISPR Biology and Technologies». Annual Review of Genetics (en inglés) 55 (1): 161-181. ISSN 0066-4197. doi:10.1146/annurev-genet-071719-022559. Consultado el 23 de octubre de 2022. 
  10. ↑ Bikard, David; Marraffini, Luciano A. (1 de noviembre de 2013). «Control of gene expression by CRISPR-Cas systems». F1000Prime Reports 5: 47. ISSN 2051-7599. PMC 3816762. PMID 24273648. doi:10.12703/P5-47. Consultado el 23 de octubre de 2022. 
  11. ↑ Deltcheva, Elitza; Chylinski, Krzysztof; Sharma, Cynthia M.; Gonzales, Karine; Chao, Yanjie; Pirzada, Zaid A.; Eckert, Maria R.; Vogel, Jörg et al. (31 de marzo de 2011). «CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III». Nature 471 (7340): 602-607. ISSN 0028-0836. PMC 3070239. PMID 21455174. doi:10.1038/nature09886. Consultado el 24 de octubre de 2022. 
  12. ↑ Briner, Alexandra E.; Donohoue, Paul D.; Gomaa, Ahmed A.; Selle, Kurt; Slorach, Euan M.; Nye, Christopher H.; Haurwitz, Rachel E.; Beisel, Chase L. et al. (23 de octubre de 2014). «Guide RNA Functional Modules Direct Cas9 Activity and Orthogonality». Molecular Cell (en inglés) 56 (2): 333-339. ISSN 1097-2765. doi:10.1016/j.molcel.2014.09.019. Consultado el 24 de octubre de 2022. 
  13. ↑ Xie, Kabin; Yang, Yinong (1 de noviembre de 2013). «RNA-Guided Genome Editing in Plants Using a CRISPR–Cas System». Molecular Plant (en english) 6 (6): 1975-1983. ISSN 1674-2052. PMID 23956122. doi:10.1093/mp/sst119. Consultado el 24 de octubre de 2022. 
  14. ↑ «Shibboleth Authentication Request». login.sire.ub.edu. Consultado el 24 de octubre de 2022. 
  15. ↑ Martin Jinek, Fuguo Jiang, David W. Taylor, Samuel H. Sternberg, Emine Kaya, Enbo Ma2, Carolin Anders, Michael Hauer, Kaihong Zhou, Steven Lin, Matias Kaplan, Anthony T. Iavarone, Emmanuelle Charpentier, Eva Nogales, and Jennifer A. Doudna (2014 March 14). «Structures of Cas9 Endonucleases Reveal RNA-Mediated Conformational Activation». Science. Consultado el 17 de octubre de 2022. 
  16. ↑ Faure, Guilhem; Shmakov, Sergey A.; Makarova, Kira S.; Wolf, Yuri I.; Crawley, Alexandra B.; Barrangou, Rodolphe; Koonin, Eugene V. (14 de agosto de 2018). «Comparative genomics and evolution of trans-activating RNAs in Class 2 CRISPR-Cas systems». RNA Biology 16 (4): 435-448. ISSN 1547-6286. doi:10.1080/15476286.2018.1493331. Consultado el 29 de octubre de 2022. 
  17. ↑ A., Haurwitz, Rachel E. Jinek, Martin Wiedenheft, Blake Zhou, Kaihong Doudna, Jennifer (10 de septiembre de 2010). Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. OCLC 847380945. Consultado el 28 de octubre de 2022. 
  18. ↑ Deltcheva, Elitza; Chylinski, Krzysztof; Sharma, Cynthia M.; Gonzales, Karine; Chao, Yanjie; Pirzada, Zaid A.; Eckert, Maria R.; Vogel, Jörg et al. (2011-03). «CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III». Nature 471 (7340): 602-607. ISSN 0028-0836. doi:10.1038/nature09886. Consultado el 28 de octubre de 2022. 
  19. ↑ «Overview of the CRISPR-Cas system and design of sgRNAs (single guide RNAs) for genomic DNA editing in yeast». 
  20. ↑ «Principles and medical applications of gene editing by CRISPR / Cas». 
  21. ↑ Thurtle-Schmidt, Deborah M.; Lo, Te-Wen (30 de enero de 2018). «Molecular biology at the cutting edge: A review on CRISPR/CAS9 gene editing for undergraduates». Biochemistry and Molecular Biology Education 46 (2): 195-205. ISSN 1470-8175. doi:10.1002/bmb.21108. Consultado el 29 de octubre de 2022. 
  22. ↑ Munawar, Nayla; Ahmad, Aftab (2021). CRISPR/Cas System: An Introduction. Springer Singapore. pp. 1-35. ISBN 978-981-15-7141-1. Consultado el 29 de octubre de 2022. 
  23. ↑ Khan, Sehrish; Mahmood, Muhammad Shahid; Rahman, Sajjad ur; Zafar, Hassan; Habibullah, Sultan; khan, Zulqarnain; Ahmad, Aftab (28 de marzo de 2018). «CRISPR/Cas9: the Jedi against the dark empire of diseases». Journal of Biomedical Science 25 (1). ISSN 1423-0127. doi:10.1186/s12929-018-0425-5. Consultado el 29 de octubre de 2022. 
  24. ↑ Karvelis, Tautvydas; Gasiunas, Giedrius; Miksys, Algirdas; Barrangou, Rodolphe; Horvath, Philippe; Siksnys, Virginijus (27 de marzo de 2013). «crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference inStreptococcus thermophilus». RNA Biology 10 (5): 841-851. ISSN 1547-6286. doi:10.4161/rna.24203. Consultado el 29 de octubre de 2022. 
  25. ↑ Pingoud, Alfred (26 de julio de 2012). «Faculty Opinions recommendation of A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.». Faculty Opinions – Post-Publication Peer Review of the Biomedical Literature. Consultado el 28 de octubre de 2022. 
  26. ↑ Emmanuelle, Jinek, Martin Chylinski, Krzysztof Fonfara, Ines Hauer, Michael Doudna, Jennifer A Charpentier, (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Umeå universitet, Molekylär Infektionsmedicin, Sverige (MIMS). OCLC 1233892747. Consultado el 28 de octubre de 2022. 
  27. ↑ Lüthy, Isabel A.; Lamb, Caroline A.; Lüthy, Isabel A.; Lamb, Caroline A. (2020-12). «Premio Nobel de Química 2020 a la edición génica con tecnología CRISPR/Cas9». Medicina (Buenos Aires) 80 (6): 738-740. ISSN 0025-7680. Consultado el 24 de octubre de 2022. 
  28. ↑ «The Nobel Prize in Chemistry 2020». NobelPrize.org (en inglés estadounidense). Consultado el 24 de octubre de 2022. 
  29. ↑ «TRABAJO FIN DE GRADO CRISPR COMO HERRAMINETA DE EDICIÓN GENÉTICA Y SUS APLICACIONES EN LA SALUD HUMANA». 
  30. ↑ Las tijeras genéticas: premio nobel de química del 2020. Acta Herediana. doi:10.20453/ah.v64i1.3917. Consultado el 24 de octubre de 2022. 
  31. ↑ «Premio Nobel de Química 2020 para las inventoras de las "tijeras genéticas"». www.nationalgeographic.com.es. 7 de octubre de 2020. Consultado el 24 de octubre de 2022. 

Enlaces externos

Obtenido de «https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=ARN_CRISPR_transactivante_(ARNtracr)&oldid=146966993»