Hibridación in situ

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La hibridación in situ (ISH) es una técnica que se utiliza para la localización y la detección de secuencias de ADN y de ARN específicas en las células, cromosomas o tejidos preservados[1] , mediante la formación de una molécula híbrida entre una molécula endógena de ARN o ADN de la célula y una sonda complementaria de ARN o de ADN monocatenario[2] . La técnica de hibridación in situ se basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia[3] . Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediante la utilización de una sonda (formada por una secuencia de ADN previamente conocida) marcada con un isótopo radiactivo, la presencia de determinada secuencia de ADN o ARN complementaria, en la muestra a estudiar. Cuando una de las dos hebras está marcado, los híbridos reconocidos pueden ser detectados por varios métodos, que pueden ser fluorescente y no fluorescente[1] . La detección in situ permite visualizar de forma directa la ubicación espacial de secuencias específicas, lo cual es esencial para dilucidar la organización y función génica, debido a esto esta técnica es de gran importancia en diversos campos, entre los cuales se encuentra el diagnóstico de rearreglos cromosomales, la detección de infecciones virales y el análisis de la función génica durante el desarrollo embrionario.

Historia[editar]

La técnica se desarrollo en el año de 1969 por dos grupos de investigación, Gall y Pardue e independientemente por Jonh et al., en el mismo año. Gall y colaboradores describieron una técnica en la cual se formaban híbridos moleculares entre RNA y DNA. La técnica fue llevada a cabo en ovocitos de Xenopus laevis, mediante la hibridacion de rRNA con rDNA extracromosomal; en los cuales detectaron la localización diferencial de los híbridos de ácidos nucléicos ha distintos estadíos usando microautoradiografia[3] . Esta técnica se caracterizo por permitir que la secuencia de ácidos nucleicos fuera detectada dentro de la célula sin alterar la morfología celular o la integridad de sus compartimentos. El uso de Hibridación in situ para "contar e identificar organismos" fue propuesto por Olsen[4] , y luego introducida a la bacteriología en el año 1988 por el grupo de Giovannoni, quienes fueron los primeros en utilizar sondas de oligonucleótidos marcadas radio activamente y dirigidas al ARNr, para la detección microscópica de bacterias[5] .

Fundamento[editar]

El objetivo de la hibridación in situ es determinar la presencia o ausencia de secuencias de DNA o RNA de interés, así como localizar estas secuencias en células específicas o sitios cromosómicos[6] . Condiciones óptimas para la hibridación de extractos purificados de DNA o RNA en soportes sólidos han sido arduamente estudiadas. Con el uso de muestras tisulares y celulares; sin embargo, nuevos problemas tales como la unión no específica de las sondas han sido encontrados. La sensibilidad de la hibridación in situ depende de las siguientes variables: la preparación de la muestra (tejido o célula), construcción de la sonda, etiquetado de la sonda y la sensibilidad del método usado para la detección[7] .

  1. Preparación de la muestra: Un pre-tratamiento puede ser llevado a cabo antes de hibridacion para aumentar la eficiencia y reducir la tinción no específica. El tratamiento con proteasas (proteinasa K la mas común) facilita el acceso hacia la secuencia objetivo. La acetilación con 0,25% de anhídrido acético o 0.1 M trietanolamina reduce la unión de las sondas en el tejido. La optimización de la preparación de la muestra, incluido la fijación y el almacenamiento, es importante para la detección intracelular de ácidos nucleicos[8] . La fijación necesita preservar el DNA o RNA y la morfología del tejido. En contraste, los procesos de síntesis y degradación enzimática de DNA o RNA deben mantenerse estables, por lo tanto el promedio de vida del mRNA es un factor importante. En este contexto, el tejido ha ser fijado debe congelarse tan pronto sea posible tras su escisión, el tiempo entre la escisión y fijación se toma en cuenta al momento de interpretar los resultados. Se utiliza para-formaldehido para la fijación, en algunos casos seguido por la adición de glutaraldehido. La fijación de ciertos tejidos se ve favorecida por mezclas de ácido acético-alcohol o el fijador de Bouin[7] .
  2. Construcción de la sonda: Diferentes tipos de sondas tales como cDNA, cRNA y oligonucleótidos sintéticos se utilizan para la hibridacion in situ. La elección de la sonda dependerá de la sensibilidad y especificidad, facilidad de producción, facilidad de la sonda para penetrar el tejido, aplicación y la reproducibilidad del método. El tamaño optimo de la sonda es 50-300 nucleótidos[6] .
  3. Etiquetado de la sonda: El etiquetado de la sonda puede realizarse mediante la incorporación de radioisótopos ( 3H, 32P, 35S, 14C, 125I ) o marcadores no radioactivos (biotina, anticuerpos específicos, entre otros). Las marcadores radioactivos se considera el método mas sensible. Los sitios de hibridación pueden visualizarse mediante radiografía con rayos-X o emulsiones liquidas[7] .
  4. Sensibilidad del método: en función de la sonda utilizada y la secuencia de interés distintas reacciones de control pueden llevarse a cabo tales como Northern o Southern Blot, Inmunoquimica, hibridacion con fragmentos de secuencia conocida, entre otros[7] .

Ventajas y Desventajas de la Hibridación in situ[editar]

La principal ventaja de la técnica es que permite usar al máximo la muestra de un tejido, logrando realizar cientos de hibridaciones diferentes en el mismo tejido[1] . Sin embargo la tecnica de hibridación in situ presenta la desventaja de estar limitada por su incapacidad para detectar secuencias que tienen bajo numero de copias de ADN y ARN. Debido a esto se han desarrollado varias estrategias para mejorar la sensibilidad de la hibridación in situ por amplificación de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico antes de la ISH o detección de la señal después de que se complete la hibridación[9] .

Tipos de Hibridación in situ[editar]

Desde la aparición de la hibridacion in situ, numerosos métodos han sido desarrollados. Entre los métodos más comunes tenemos:[1]

  • PCR con hibridacion in situ: Se usa para la amplificación de secuencias especificas de ADN o ARN en células o secciones de tejido, de forma que el número de copias se incrementen en PCR in situ a niveles detectables por métodos estándar de  hibridación in situ. Su principal utilidad se da para identificar secuencias de ADN que no son fáciles de detectar usando hibridación in situ estándar. Sin embargo esta técnica posee una baja eficiencia de amplificación y una mala reproducibilidad[10] .
  • Hibridación in situ con fluorescencia (FISH): Es una técnica que detecta secuencias de ácidos nucleicos en células o tejidos preservados mediante el empleo de una sonda marcada con un fluorocromo, la cual va dirigida hacia un lugar específico del cromosoma y que emite fluorescencia que puede ser observada por medio de un microscopio[11] . Se caracteriza por permitir la visualización directa de las alteraciones genéticas en la célula[1] .
  • Multicolor FISH: En el FISH multicolor, se usa dos o mas sondas marcadas específicamente, las cuales luego de hibridarse con las secuencias de la muestra , son identificadas con diferentes colores fluorescentes. Esta es una técnica eficaz para buscar anomalías cromosómicas, que a pesar de ser cara, presenta la ventaja de permitir pueden evaluar múltiples sitios cromosómicos[1] .
  • Hibridación in situ con cromógenos (CISH): En este tipo de hibridación se utilizan reacciones de peroxidasa o fosfatasa alcalina usando microscopía de campo brillante en tejidos fijados por formalina y embebidos en parafina. Estos anticuerpos reportero marcadas con fosfatasa peroxidasa o alcalinas interactúan con una sonda de ADN hibridada, y luego se observan con una reacción enzimática. CISH permite examinar la deleción de un gen, translocaciones cromosómicas, y el número cromosómico.
  • Hibridación in situ genomica (GISH): Se utiliza con el fin de distinguir los cromosomas de diferentes progenitores o de diferentes genomas en híbridos interespecíficos o alopoliploides. La característica principal de esta técnica es que mientras FISH utiliza secuencias específicas de ADN como sondas, GISH utiliza ADN genómico de una especie como sonda. El gran avance de esta técnica en relación a FISH es el etiquetado de genomas enteros, haciéndolo ventajoso en muchos estudios, por ejemplo, en la identificación de genomas y en el análisis meiótico[12] .

Véase también[editar]