Espectrofotometría

Espectrofotómetro

Se denomina espectrofotometría al conjunto de técnicas de análisis utilizadas para determinar la concentración de sustancias químicas en disolución mediante el empleo de energía electromagnética a longitudes de onda previamente seleccionadas. Un haz de radiación electromagnética, generalmente con longitud de onda característica de las regiones ultravioleta, visible o infrarroja, se hace pasar a través de la disolución que contiene el analito. Parte de la radiación es absorbida por las moléculas presentes y parte es trasmitida. La diferencia entre la intensidad lumínica inicial y la que finalmente llega al detector, tras atravesar la disolución, está relacionada con la concentración de la sustancia absorbente, por lo que, midiendo la absorbancia o la transmitancia puede determinarse la concentración (ley de Beer-Lambert)

Fundamento

La absorción de radiación ultravioleta, visible o infrarroja tiene interés en el análisis para la identificación de especies tanto orgánicas como inorgánicas. La espectrofotometría que utiliza radiaciones electromagnéticas de las regiones ultravioleta y visible del espectro se utiliza básicamente en el análisis cuantitativo, siendo empleada extensamente tanto en los laboratorios de análisis químico como en los de análisis clínico. La espectroscopia de absorción infrarroja, especialmente la correspondiente a la región media del infrarrojo, entre aproximadamente 2,5-25 μm de longitud de onda, es una herramienta muy poderosa para la identificación y determinación de las estructuras de compuestos orgánicos e inorgánicos, aunque también desempeña una función muy importante en el análisis cuantitativo, sobre todo, en el análisis medioambiental. En la espectrofotometría se utiliza principalmente la absorción de radiación electromagnética en la zona del ultravioleta, visible e infrarroja del espectro, aunque también puede producirse absorción de radiación electromagnética en otras regiones del espectro.

La radiación electromagnética puede ser descrita tanto en términos de partículas (denominadas fotones) como de ondas (teoría dual onda-corpúsculo). Cada fotón de radiación electromagnética lleva asociado a su movimiento una cantidad energía, que depende de la frecuencia de la radiación y viene expresada mediante la conocida como ecuación de Plank:

$E=h\nu$

Diagrama de niveles de energía molecular mostrando la diferencia entre la absorción de radiación infrarroja y la ultravioleta-visible.

donde $h$ es la constante de Plank (6,626 x 10^-34 J·s) y $\nu$ es la frecuencia de la radiación en Hz. Cuando una molécula absorbe un fotón, la energía de este fotón pasa a la molécula, aumentando su energía. Se dice entonces, que la molécula ha pasado de un estado fundamental de energía a un estado excitado. Puesto que la energía de los fotones absorbidos dependen de la frecuencia de la radiación electromagnética, dependiendo de la región espectral y de la longitud de onda seleccionada, los efectos que tendrán sobre la molécula serán diferentes. Así, por ejemplo. la absorción de fotones de radiación de microondas estimula el movimiento rotacional de las moléculas. La radiación infrarroja afecta al movimiento vibracional de las moléculas cuando la absorben, mientras que las radiaciones visible y UV hacen que los electrones pasen a orbitales de mayor energía. Si los fotones son muy energéticos, es decir la radiación es de alta frecuencia, como por ejemplo, los rayos X y la radiación UV de longitud de onda corta (ultravioleta lejano), se producen cambios irreversibles en las moléculas, ya que se rompen enlaces químicos que ionizan a las moléculas, por lo que son de menor interés en el análisis cuantitativo.

En la espectrofotometría se mide la cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica de cada sustancia química. Existen una serie de leyes fundamentales que permiten relacionar la cantidad de energía electromagnética absorbida con la concentración de las especies químicas que la absorbe. La primera de esta leyes fue formulada inicialmente por Bouguer en 1729 y posteriormente redefinida por Lambert, por lo que habitualmente se la denomina con el nombre de este último.

Ley de Lambert

La ley de Lambert (o de Bouguer), en lo que a la absorción de la radiación luminosa se refiere, establece de que cada unidad de longitud de un material absorbente homogéneo (solido transparente o disolución), a través del cual pasa la luz, absorbe la misma fracción de radiación, por lo que si un haz luminoso monocromático de intensidad I se trasmite a través de dicho material, este irá perdiendo intensidad lumínica de acuerdo con la ecuación diferencial:

$dI=-kI\,db$

donde k es una constate de proporcionalidad que depende de la longitud de onda empleada, de la temperatura y del material de que esté hecho el medio absorbente y b es la distancia recorrida por el haz luminoso. El signo negativo indica que se produce una disminución de la intensidad luminosa. . La ecuación puede modificarse reordenando términos:

${\frac {dI}{I}}=-k\,db$

que una vez integrada, se obtiene la expresión matemática de la ley de Lambert de la absorción luminosa:

$ln{\frac {I}{I_{0}}}=-k\,b$

que también puede expresarse en notación logarítmica decimal:

$log{\frac {I}{I_{0}}}={\frac {-k}{2,303}}\,b$

La relación entre la intensidad lumínica trasmitida (I) y la inicial (I₀), se conoce con el nombre de transmitancia (T) y puesto que tiene unidades de intensidad por unidad de tiempo, también es frecuente expresarla como irradiancia, P y P₀.

Ley de Lambert-Beer

La ley de Lambert es una ley que se cumple para cualquier medio homogéneo, sólido, líquido (incluidas las disoluciones) y gaseoso siempre que no sea dispersivo. Sin embargo, en el caso de las disoluciones químicas con sustancias absorbentes, también tiene un gran efecto sobre la variación de la intensidad luminosa del haz de radiación electromagnética, la concentración de dicha sustancia. August Beer encontró que un aumento de la concentración de sustancia absorbente produce el mismo efecto que un aumento de la longitud del paso óptico, b, en la ley de Lambert, redefiniendo dicha ley en términos de concentración:

$log{\frac {I}{I_{0}}}=T={\frac {-k}{2,303}}\,b\cdot C$

A la inversa de la transmitancia, T la denomino absorbancia, A, de forma que la anterior ley de Lambert quedó modificada como:

$log{\frac {I_{0}}{I}}={\frac {1}{T}}=A$

con lo que, agrupando términos, queda la expresión matemática conocida como ley de Beer.

$A=k\cdot b\cdot C$

donde ahora k representa la proporcionalidad conjunta entre absorbancia y el paso óptico multiplicado por la concentración. Aunque fue Beer el que relacionó la cantidad de radiación trasmitida a través de una disolución, con la concentración de las sustancias absorbentes, al estar basada en una ley anterior, a menudo se referencia a ella como Ley de Lamber-Beer o incluso, en reconocimiento al primer científico que vislumbró la misma, como Ley de Bouguer-Lamber-Beer. Esta ley afirma que "a mayor concentración, mayor absorbancia", y que si se mantiene la distancia o recorrido óptico constante, la relación con la concentración de sustancia absorbente es lineal, aspecto este muy importante en el análisis químico cuantitativo, ya que permite determinar la concentración en disolución de aquellas sustancias que presentan algún tipo de absortividad, bien a la radiación infrarroja como a la visible o a la ultravioleta.

Finalmente, en cuanto a unidades se refiere, la absorbancia es una magnitud adimensional, sin unidades, pues proviene del cociente de una magnitud física (I o P), mientras que el paso óptico, b es frecuente expresarlo en cm, pues la mayoría de las celdas donde se coloca la muestra en los aparatos de medida apenas tienen uno o dos centímetros en el caso de la espectrofotometria ultravioleta-visible o de unos pocos milímetros en la espectrofotometría infrarroja. Si la concentración se expresa en g/L, k (a veces se sustituye por ɑ) se denomina absortividad específica y tiene unidades son L·g^-1·L^-1 y si se expresa en unidades internacionales, M, se sustituye k (o ɑ) por ɛ (epsilon) y la magnitud recibe el nombre de absortividad molar, siendo sus unidades M^-1·cm^-1. Como la absortividad depende de la longitud de onda empleada, a menudo se indica esta como un subíndice y la unidad de longitud. Así por ejemplo, si la medida se hace a λ = 530 nm, la ecuación de Beer quedaría:

$A=\epsilon _{530nm}\cdot b\cdot C$

Medida de la absorbancia

La espectrofotometría implica la medida de la fracción de radiación electromagnética de una longitud de onda determinada que atraviesa una disolución que contiene la muestra a analizar. Con esta finalidad se han diseñado diferentes instrumentos que genéricamente reciben el nombre de espectrofotómetros. La mayoría de los espectrofotómetros constan de una serie de componentes básicos:

• Fuente de radiación adecuada a la región del espectro electromagnético empleada.
• Selector de longitud de onda.
• Cubetas o celdas para contener la muestra.
• Un detector de radiación que convierta la energía radiante en una señal eléctrica medible.
• Un procesador de la señal que permita la lectura de la señal eléctrica procedente del detector.

Esquema básico de un espectrofotómetro de absorción

La fuente de radiación, generalmente es una fuente de emisión continua, es decir emite la energía radiante de manera ininterrumpida en un amplio intervalo de longitudes de onda, aunque en algunas aplicaciones muy concretas y específicas se utilizan fuentes de emisión en líneas discretas, como láseres. Puesto que la absorción de los fotones se produce a una longitud determinada, es preciso dirigir el haz de radiación hacia un selector de longitud de onda, que bien, mediante un sistema de filtros elimine la mayor parte de las longitudes de onda no seseadas o bien, mediante un monocromador (prisma óptico o red de difracción) seleccione una banda estrecha de longitudes de onda lo más próxima posible a la longitud de onda analítica; es decir, la que se absorbe preferentemente. Esta luz monocromática atraviesa una muestra líquida que se encuentra contenida en el interior de una celda de media, habitualmente denominada cubeta de muestra. Tras atravesar la muestra, el haz de radiación parcialmente absorbido es dirigido hacia el detector, que es un dispositivo capaz de convertir la radiación electromagnética incidente en una pequeña corriente eléctrica, de mayor intensidad cuanto mayor es la cantidad de fotones que llegan al detector. Esta señal eléctrica es debidamente procesada para que pueda ser medida y mediante los dispositivos adecuados, poder ser leída en magnitudes de absorbancia o de transmitancia.

Espectrofotómetros

No existe un tipo de espectrofotómetro capaz de medir la absorbancia en todo el intervalo espectral comprendido entre el ultravioleta próximo y el infrarrojo medio, que son las zonas espectrales de uso habitual en la espectrofotometría de absorción. Tanto los componentes electrónicos para la emisión o detección de la energía radiante, así como el material óptico empleado para lentes, cubetas, etc. debe ser el adecuado para cada tipo de radiación. Como elementos emisores o fuentes de radiación continua, se utilizan lámparas de deuterio o lámparas de hidrógeno cuando la absorción de la radiación va a ser medida en el ultravioleta próximo, ya que estos gases, estimulados mediante descargas eléctricas de bajo voltaje, emiten de forma continua este tipo de radiación entre 160 y 375 nm. Para medidas en la región visible, la fuente de radiación más habitual suele ser una lámpara halógena de filamento de wolframio, que emite radiación útil en el intervalo de los 350 a los 2500 nm. En cuanto al infrarrojo medio, que cubre la región espectral de longitudes de onda entre 2500 nm (2,5 μm) y 50 μm, que es donde se producen los cambios en los momentos de vibración de las moléculas, la fuentes habitualmente utilizadas son sólidos inertes que calentados a temperaturas de 1500 a 2000 K tienen comportamientos similares al de un cuerpo negro ideal con un máximo de emisión radiante alrededor de 1,5 μm de longitud de onda. Los dispositivos más utilizados son la fuente globar (una varilla de carburo de silicio calentada a unos 1500 K ) y el emisor de Nernst; un pequeño cilindro hueco formado por una mezcla de óxidos de itrio y torio que, previamente calentado, se convierte en conductor eléctrico, aunque con una resistencia que hace que alcance un temperatura próxima a los 2000 K. Algo similar ocurre con los detectores; no existe un detector universal que cubra todo el espectro entre el ultravioleta y el infrarrojo. Para las regiones del ultravioleta y del visible, los detectores más sencillos y versátiles son los fototubos y los tubos fotomultiplicadores; aunque en los espectrofotómetros más modernos es muy frecuente que se fabriquen con detectores basados en dispositivos de acoplamiento de carga (CDD), mucho más sensibles. Para la detección de radiación infrarroja habitualmente se utilizan termopares y bolómetros y dispositivos piroeléctricos; es decir, sensores que generan una carga eléctrica en respuesta a variaciones de temperatura.

En cuanto a los materiales con los que se fabrican estos componentes, también están afectado por el tipo de radiación electromagnética a emplear. Es condición indispensable que las celdas, ventanas, lentes, espejos y elementos para seleccionar longitudes de onda del espectrofotómetro no absorban el tipo de radiación utilizando, permitiendo la reflexión, en el caso de los espejos, o la trasmisión, en el caso de ventanas, lentes, etc. sin apenas pérdidas de intensidad radiactiva, tanto si es por dispersión como por absorción. En consecuencia, materiales de vidrio no son adecuados en la espectrofotometría que utiliza radiación ultravioleta, ya que este material absorbe radiación ultravioleta a longitudes de onda menores que aproximadamente 380 nm, mientras que en la región del infrarrojo medio el vidrio, el cuarzo y la sílice fundida absorben a longitudes de onda mayores que aproximadamente 2.5 μm (2500 nm). En consecuencia, los elementos ópticos para espectrometría IR generalmente están hechos de sales de halógeno o en algunos casos de materiales poliméricos; los espectrofotómetros para visible (también conocidos como colorímetros) utilizan óptica de vidrio de calidad, ya que es muy económico, pero si se desea un espectrofotómetro que permita hacer tanto medidas en el ultravioleta próximo (λ > 190 nm) como en la región visible, algo muy frecuente, el espectrofotómetro debe utilizar óptica de cuarzo o de sílice fundida.

Tipos de espectrofotómetros

En el mercado hay disponibles diversos tipos de espectrofotómetros, la mayoría dedicados al análisis espectrofotométrico UV-vis, el más habitual y extendido. Algunos son muy sencillos y económicos, diseñados específicamente para trabajar con radiación visible (colorímetros y fotómetros de filtros), pero también hay complejos aparatos de amplio rango que permiten medir tanto en ultravioleta, como en radiación visible e infrarroja próxima. En general, existen dos clases principales de dispositivos: de haz simple y de doble haz.

Los espectrofotómetros de haz simple son muy sencillos y requieren un óptica más simple que los de doble haz. En estos espectrofotómetros, la radiación luminosa procedente de la fuente se aísla, mediante filtros o con un monocromador, una banda estrecha de longitud de onda adecuada al analito que se va a determinar, haciéndola pasar a través de una muestra, y se mide mediante un detector. Primero se mide la irradiancia (P₀ W/m² o I₀) que llega al detector haciendo pasar el haz de radiación monocromática por una cubeta de referencia (un blanco de disolvente o de reactivo), colocada en el compartimiento de muestras. Tras esta operación, se sustituye el blanco por la muestra y se repite la operación, obteniéndose el valor de P o I. Cuanto mayor sea la absorbancia, mas próximo a cero será la relación P/P₀; es decir , la transmitancia. Una vez realizada las medidas, es posible determinar la concentración, mediante la aplicación de la ley de Beer. Este tipo de instrumentos presenta algunos inconvenientes, el principal es que al tener que colocar la muestra y la referencia de forma alterna en el camino del haz el trabajo es algo tedioso y si hay que hacer medidas a diferentes longitudes de onda, hay que seleccionar la nueva longitud de onda y ajustar el espectrofotómetro, ya que las fuentes de radiación no emiten con la misma intensidad para cada longitud de onda. Además, un instrumento de haz simple es poco indicado para medir absorbancias en función del tiempo, como en trabajos de cinética, porque tanto la intensidad de la fuente como la respuesta del detector van variando lentamente.

Un espectrofotómetro de doble haz compara simultáneamente la intensidad de la luz entre dos trayectorias ópticas: una con una muestra de referencia y la otra con la muestra de prueba. Mediante diferentes dispositivos, el haz de radiación monocromática se divide en dos haces de igual intensidad. Uno de ellos pasa a través de la disolución de referencia hacia un fotodetector, mientras que el otro pasa simultáneamente a través de la muestra a un segundo fotodetector igualado. En otros diseños los haces se separan en el tiempo mediante un espejo de sectores rotatorios que dirige el haz completo a través de la celda de referencia y posteriormente, casi simultáneamente, a través de la celda de muestra y se dirigen hacia un único detector.

Si bien las mediciones comparativas de los instrumentos de doble haz son más sencillas y estables, los instrumentos de haz simple ofrecen un mayor rango dinámico y son ópticamente más simples y compactos. Además, algunos instrumentos especializados, como los espectrofotómetros integrados en microscopios o telescopios, son de haz simple por razones prácticas.

Aplicaciones

Las primeras aplicaciones de la espectrofotometría de absorción molecular tuvieron sus comienzos en el primer tercio del siglo XIX, con el empleo de la colorimetría, denominada así por utilizar exclusivamente radiación visible como fuente de radiación. En los primeros colorímetros, la determinación de la concentración de analitos se llevaba a cabo visualmente, comparando el color de la muestra con el de una serie de patrones mediante tubos de Nessler empleando un instrumento llamado colorímetro. A comienzos de ese mismo siglo se descubrió la radiación ultravioleta y la infrarroja, pero su uso en espectrofotometría, al no ser posible detectarla visualmente, como en el caso de la radiación visible, no tuvo aplicación alguna en espectrofotometría al no disponerse de un método práctico para detectarlas. No obstante, la situación cambió a finales del primer tercio del siglo XX, cuando se descubrieron los detectores fotoeléctricos, capaces de detectar radiación ultravioleta y visible y los termopares, que permitían detectara la radiación infrarroja. Estos y otros descubrimientos y avances en el campo de la electrónica permitieron fabricar cada vez instrumentos más sofisticados que permitían medir la absorción de este tipo de radiaciones, generalizándose su empleo en el análisis químico.

Las aplicaciones principales son:

• determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto utilizando las fórmulas ya mencionadas;
• ayudar en la determinación de estructuras moleculares;
• la identificación de unidades estructurales específicas, ya que estas tienen distintos tipos de absorbancia (grupos funcionales o isomerías);
• determinar constantes de disociación de indicadores ácido-base;
• estandarización de colores de diversos materiales, como plásticos y pinturas.

Tipos de espectrofotometría

• espectrofotometría de absorción molecular VIS-UV. 13
• espectrofotometría de absorción molecular IR.15
• espectrofotometría de absorción y emisión atómica
• espectrofotometría con atomizadores electrotérmicos
• espectrofotometría de emisión con plasma
• espectrofotometría de fluorescencia molecular

Véase también

• colorimetría
• colorímetro
• ensayo químico
• espectro electromagnético
• espectrofluorimetría
• espectrofotómetro
• química

Enlaces externos

• Espectrofotometría

Referencias

• Datos: Q332084
• Multimedia: Spectrophotometry / Q332084