Edición del epigenoma

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Una descripción visual de cómo se utilizan las proteínas TALE para la edición del epigenoma

La edición del epigenoma o la ingeniería del epigenoma es un tipo de ingeniería genética en la que el epigenoma se modifica en sitios específicos utilizando moléculas diseñadas dirigidas a esos sitios (a diferencia de las modificaciones de todo el genoma). Mientras que la edición de genes implica cambiar la secuencia de ADN en sí, la edición epigenética implica modificar secuencias de ADN y otros factores de unión al ADN que influyen en su funcionamiento. Al "editar" características epigenómicas se puede determinar el papel biológico exacto de una modificación epigenética.

Las proteínas diseñadas que se utilizan para la edición del epigenoma están compuestas por un dominio de unión al ADN que se dirige a secuencias específicas y un dominio efector que modifica las características epigenómicas. Se han utilizado predominantemente tres grupos principales de proteínas de unión al ADN para la edición del epigenoma: proteínas con dedos de zinc, efectores similares a activadores de la transcripción (TALE) y fusiones de Cas9 deficientes en nucleasa (CRISPR).

Definición[editar]

La comparación de mapas epigenéticos de todo el genoma con la expresión genética ha permitido a los investigadores asignar funciones activadoras o represoras a modificaciones específicas. La importancia de la secuencia de ADN en la regulación del epigenoma se ha demostrado mediante el uso de motivos de ADN para predecir la modificación epigenómica.[1]​ Se han estudiado los mecanismos detrás de la epigenética a partir de análisis bioquímicos y estructurales in vitro. Utilizando organismos modelo se han podido describir el papel de muchos factores de la cromatina mediante estudios knockout. Sin embargo, eliminar un modificador completo de la cromatina tiene efectos masivos en todo el genoma, lo que puede no ser una representación precisa de su función en un contexto específico. Como ejemplo de esto, la metilación del ADN ocurre en regiones repetidas, promotores, potenciadores y cuerpos genéticos. Aunque la metilación del ADN en los promotores de genes generalmente se correlaciona con la represión genética, la metilación en los cuerpos de los genes se correlaciona con la activación de los genes y la metilación del ADN también puede desempeñar un papel en el empalme de genes.[2]​ La capacidad de apuntar y editar directamente sitios de metilación individuales es fundamental para determinar la función exacta de la metilación del ADN en un sitio específico. Para la edición de metilación del ADN de un sitio específico, así como para la edición de histonas, los sistemas de edición del genoma se han adaptado a sistemas de edición de epigenes.

Las proteínas de localización del genoma con funciones de nucleasa diseñadas o de origen natural para la edición de genes pueden mutarse y adaptarse a sistemas puramente de administración. Se puede fusionar una enzima o dominio modificador epigenético a la proteína de localización y se pueden alterar modificaciones epigenéticas locales tras el reclutamiento de proteínas.

Proteínas dirigidas[editar]

TALE[editar]

La proteína efectora similar al activador de la transcripción (TALE) reconoce secuencias de ADN específicas según la composición de su dominio de unión al ADN.[3]​ Esto permite al investigador construir diferentes proteínas TALE para reconocer una secuencia de ADN objetivo mediante la edición de la estructura proteica primaria de TALE. La especificidad de unión de esta proteína generalmente se confirma mediante inmunoprecipitación de cromatina ChIP y secuenciación de Sanger del fragmento de ADN resultante.[4]​[5]​[6]​ Esta confirmación todavía es necesaria en todas las investigaciones sobre reconocimiento de secuencias de TALE.[7]​ Cuando se utilizan para la edición del epigenoma, estas proteínas de unión al ADN se unen a una proteína efectora. Las proteínas efectoras que se han utilizado para este propósito incluyen la metilcitosina dioxigenasa 1 de translocación diez-once (TET1),[5]​ la desmetilasa 1A específica de lisina (K) (LSD1)[6]​ y la proteína 1 de unión a calcio e integrina (CIB1).[4]​

Proteínas con dedos de zinc[editar]

También se ha explorado el uso de proteínas de fusión con dedos de zinc para reconocer sitios para la edición del epigenoma. Se construyó una proteína ZF-TET1 para usar en la desmetilación del ADN.[5]​ Estas proteínas con dedos de zinc funcionan de manera similar a las proteínas TALE en el sentido de que pueden unirse a secuencias de sitios específicos en el ADN en función de su estructura proteica que puede modificarse. También se ha utilizado un dominio de unión al ADN con dedos de zinc acoplado con la proteína TET1 para inducir la desmetilación de varios genes previamente silenciados.[8]​ Kungulovski y Jeltsch utilizaron con éxito la deposición guiada por ZFP del gen de metilación del ADN para provocar el silenciamiento del gen, pero la metilación y el silenciamiento del ADN se perdieron cuando se detuvo la señal desencadenante. Los autores sugieren que para que los cambios epigenéticos sean estables, debe haber múltiples depósitos de metilación del ADN de marcas epigenéticas relacionadas o estímulos desencadenantes duraderos.[9]​ La edición epigenética de ZFP ha demostrado potencial para tratar diversas enfermedades neurodegenerativas.[10]​

CRISPR-Cas[editar]

El sistema Cass de repetición palindrómica corta interespaciada reguladora agrupada (CRISPR) funciona como una nucleasa específica de un sitio de ADN.[11]​ En el bien estudiado sistema CRISPR de tipo II, la nucleasa Cas9 se asocia con una quimera compuesta de tracrRNA y crRNA. Esta quimera se denomina frecuentemente ARN guía (ARNg). Cuando la proteína Cas9 se asocia con un ARNg específico de una región de ADN, Cas9 escinde el ADN en los loci de ADN específicos. Sin embargo, cuando se introducen las mutaciones puntuales D10A y H840A, se genera una Cas9 catalíticamente muerta (dCas9) que puede unirse al ADN, pero no se escinde.[12]​ El sistema dCas9 se ha utilizado para la reprogramación epigenética dirigida con el fin de introducir la metilación del ADN en un sitio específico. Al fusionar el dominio catalítico DNMT3A con la proteína dCas9, dCas9-DNMT3a es capaz de lograr la metilación específica del ADN de una región objetivo, como se especifica en el presente ARN guía.[13]​ De manera similar, dCas9 se ha fusionado con el núcleo catalítico de la acetiltransferasa p300 humana. dCas9-p300 cataliza con éxito la acetilación dirigida de la histona H3 lisina 27.[14]​[15]​

Una variante de edición del epigenoma CRISPR (llamada FIRE-Cas9) permite revertir los cambios realizados, en caso de que algo salga mal.[16]​[17]​

CRISPRoff es una proteína de fusión Cas9 muerta que puede usarse para silenciar hereditariamente la expresión genética de "la mayoría de los genes" y permite modificaciones reversibles.[18]​[19]​

Proteínas efectoras de uso común[editar]

"TET1 induce la desmetilación de la citosina en los sitios CpG". Esta proteína se ha utilizado para activar genes reprimidos por la metilación de CpG y para determinar el papel de los sitios de metilación de CpG individuales.[5]​ El LSD1 induce la desmetilación de H3K4me1/2, lo que también provoca un efecto indirecto de desacetilación sobre H3K27. Este efector se puede utilizar en histonas en regiones potenciadoras, lo que puede cambiar la expresión de genes vecinos.[6]​ CIB1 es un criptocromo sensible a la luz, este criptocromo está fusionado a la proteína TALE. Una segunda proteína contiene un compañero de interacción (CRY2) fusionado con un modificador de cromatina/ADN (por ejemplo, SID4X). CRY2 puede interactuar con CIB1 cuando el criptocromo se activa mediante iluminación con luz azul.[20]​ La interacción permite que el modificador de cromatina actúe en el lugar deseado. Esto significa que la modificación se puede realizar de forma inducible y reversible, lo que reduce los efectos secundarios a largo plazo que causaría la modificación epigenética constitutiva.[4]​

Aplicaciones[editar]

Estudio de la función y actividad potenciadora[editar]

Se ha demostrado la edición de regiones potenciadoras de genes en el genoma mediante modificación epigenética dirigida. Este estudio utilizó una proteína de fusión efectora TALE-LSD1 para apuntar a potenciadores de genes, inducir el silenciamiento del potenciador y deducir la actividad del potenciador y el control de genes. Dirigirse a potenciadores específicos seguidos de RT-qPCR específica de locus permite determinar los genes afectados por el potenciador silenciado. Alternativamente, inducir el silenciamiento potenciador en regiones aguas arriba de los genes permite alterar la expresión génica. Luego se puede utilizar RT-qPCR para estudiar los efectos de esto en la expresión genética. Esto permite estudiar en detalle la función y la actividad del potenciador.[6]​

Determinación de la función de sitios de metilación específicos[editar]

Es importante comprender el papel que desempeñan los sitios de metilación específicos en la regulación de la expresión genética. Para estudiar esto, un grupo de investigación utilizó una proteína de fusión TALE-TET1 para desmetilar un único sitio de metilación de CpG.[5]​ Aunque este enfoque requiere muchos controles para garantizar la unión específica a los loci objetivo, un estudio realizado correctamente utilizando este enfoque puede determinar la función biológica de un sitio de metilación de CpG específico.[5]​

Determinar directamente el papel de las modificaciones epigenéticas[editar]

La edición epigenética mediante un mecanismo inducible ofrece una amplia gama de usos potenciales para estudiar los efectos epigenéticos en diversos estados. Un grupo de investigación empleó un sistema optogenético de dos híbridos que integraba el dominio de unión al ADN TALE específico de secuencia con una proteína criptocromo 2 sensible a la luz (CIB1). Una vez expresado en las células, el sistema pudo editar de forma inducible las modificaciones de las histonas y determinar su función en un contexto específico.[4]​

Ingeniería funcional[editar]

La regulación dirigida de genes relacionados con enfermedades puede permitir nuevas terapias para muchas enfermedades, especialmente en los casos en los que aún no se han desarrollado terapias génicas adecuadas o son inapropiadas.[21]​ Si bien las consecuencias transgeneracionales y a nivel poblacional no se comprenden completamente, puede convertirse en una herramienta importante para la genómica funcional aplicada y la medicina personalizada.[22]​ Al igual que con la edición de ARN, no implica cambios genéticos ni los riesgos que los acompañan.[21]​ En 2021 se describió un ejemplo de un posible uso funcional de la edición del epigenoma: la represión de la expresión del gen Nav1.7 mediante CRISPR-dCas9, que mostró potencial terapéutico en tres modelos de ratón con dolor crónico.[23]​[24]​

Una investigación evaluó su utilidad para reducir los niveles de proteína tau, regular una proteína implicada en la enfermedad de Huntington, combatir una forma hereditaria de obesidad y el síndrome de Dravet.[25]​

Limitaciones[editar]

La especificidad de la secuencia es de vital importancia en la edición del epigenoma y debe verificarse cuidadosamente (esto se puede hacer mediante inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación de Sanger para verificar la secuencia objetivo). Se desconoce si la fusión TALE puede provocar efectos sobre la actividad catalítica del modificador del epigenoma. Esto podría ser especialmente importante en proteínas efectoras que requieren múltiples subunidades y complejos como el complejo represivo Polycomb. Las proteínas utilizadas para la edición del epigenoma pueden obstruir ligandos y sustratos en el sitio objetivo. La propia proteína TALE puede incluso competir con factores de transcripción si están dirigidos a la misma secuencia. Además, los sistemas de reparación del ADN podrían revertir las alteraciones de la cromatina e impedir que se realicen los cambios deseados. [7]​

Véase también[editar]

Referencias[editar]

  1. ↑ Whitaker JW, Chen Z, Wang W (March 2015). «Predicting the human epigenome from DNA motifs». Nature Methods 12 (3): 265-72, 7 p following 272. PMC 4344378. PMID 25240437. doi:10.1038/nmeth.3065. 
  2. ↑ Jones, Peter A. (2012-07). «Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond». Nature Reviews Genetics (en inglés) 13 (7): 484-492. ISSN 1471-0064. doi:10.1038/nrg3230. 
  3. ↑ Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF (July 2013). «ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering». Trends in Biotechnology 31 (7): 397-405. PMC 3694601. PMID 23664777. doi:10.1016/j.tibtech.2013.04.004. 
  4. ↑ a b c d Konermann S, Brigham MD, Trevino A, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RJ, Scott DA, Church GM, Zhang F (August 2013). «Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states». Nature 500 (7463): 472-476. Bibcode:2013Natur.500..472K. PMC 3856241. PMID 23877069. doi:10.1038/nature12466. 
  5. ↑ a b c d e f Maeder ML, Angstman JF, Richardson ME, Linder SJ, Cascio VM, Tsai SQ, Ho QH, Sander JD, Reyon D, Bernstein BE, Costello JF, Wilkinson MF, Joung JK (December 2013). «Targeted DNA demethylation and activation of endogenous genes using programmable TALE-TET1 fusion proteins». Nature Biotechnology 31 (12): 1137-42. PMC 3858462. PMID 24108092. doi:10.1038/nbt.2726. 
  6. ↑ a b c d Mendenhall EM, Williamson KE, Reyon D, Zou JY, Ram O, Joung JK, Bernstein BE (December 2013). «Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers». Nature Biotechnology 31 (12): 1133-6. PMC 3858395. PMID 24013198. doi:10.1038/nbt.2701. 
  7. ↑ a b Voigt P, Reinberg D (December 2013). «Epigenome editing». Nature Biotechnology 31 (12): 1097-9. PMID 24316647. doi:10.1038/nbt.2756. 
  8. ↑ Chen H, Kazemier HG, de Groote ML, Ruiters MH, Xu GL, Rots MG (February 2014). «Induced DNA demethylation by targeting Ten-Eleven Translocation 2 to the human ICAM-1 promoter». Nucleic Acids Research 42 (3): 1563-74. PMC 3919596. PMID 24194590. doi:10.1093/nar/gkt1019. 
  9. ↑ Kungulovski G, Nunna S, Thomas M, Zanger UM, Reinhardt R, Jeltsch A (18 de marzo de 2015). «Targeted epigenome editing of an endogenous locus with chromatin modifiers is not stably maintained». Epigenetics & Chromatin 8 (1): 12. PMC 4404288. PMID 25901185. doi:10.1186/s13072-015-0002-z. 
  10. ↑ Bustos FJ, Ampuero E, Jury N, Aguilar R, Falahi F, Toledo J, Ahumada J, Lata J, Cubillos P, Henríquez B, Guerra MV, Stehberg J, Neve RL, Inestrosa NC, Wyneken U, Fuenzalida M, Härtel S, Sena-Esteves M, Varela-Nallar L, Rots MG, Montecino M, van Zundert B (December 2017). «Epigenetic editing of the Dlg4/PSD95 gene improves cognition in aged and Alzheimer's disease mice». Brain 140 (12): 3252-3268. PMC 5841035. PMID 29155979. doi:10.1093/brain/awx272. 
  11. ↑ Biolabs, New England. «CRISPR/Cas9 and Targeted Genome Editing: A New Era in Molecular Biology | NEB». www.neb.com. Consultado el 7 de junio de 2016. 
  12. ↑ «Addgene: CRISPR/Cas9 Guide». www.addgene.org. Consultado el 7 de junio de 2016. 
  13. ↑ McDonald JI, Celik H, Rois LE, Fishberger G, Fowler T, Rees R, Kramer A, Martens A, Edwards JR, Challen GA (June 2016). «Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation». Biology Open 5 (6): 866-74. PMC 4920199. PMID 27170255. doi:10.1242/bio.019067. 
  14. ↑ Hilton IB, D'Ippolito AM, Vockley CM, Thakore PI, Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA (May 2015). «Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers». Nature Biotechnology 33 (5): 510-7. PMC 4430400. PMID 25849900. doi:10.1038/nbt.3199. 
  15. ↑ Cervantes-Gracia, Karla; Gramalla-Schmitz, Anna; Weischedel, Julian; Chahwan, Richard (2021-11). «APOBECs orchestrate genomic and epigenomic editing across health and disease». Trends in genetics: TIG 37 (11): 1028-1043. ISSN 0168-9525. PMID 34353635. doi:10.1016/j.tig.2021.07.003. 
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  19. ↑ Nuñez, James K.; Chen, Jin; Pommier, Greg C.; Cogan, J. Zachery; Replogle, Joseph M.; Adriaens, Carmen; Ramadoss, Gokul N.; Shi, Quanming et al. (29 de abril de 2021). «Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing». Cell (en inglés) 184 (9): 2503-2519.e17. ISSN 0092-8674. PMC 8376083. PMID 33838111. doi:10.1016/j.cell.2021.03.025. 
  20. ↑ Liu, Hongtao; Yu, Xuhong; Li, Kunwu; Klejnot, John; Yang, Hongyun; Lisiero, Dominique; Lin, Chentao (5 de diciembre de 2008). «Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis». Science (en inglés) 322 (5907): 1535-1539. ISSN 0036-8075. doi:10.1126/science.1163927. 
  21. ↑ a b Kungulovski, Goran; Jeltsch, Albert (1 de febrero de 2016). «Epigenome Editing: State of the Art, Concepts, and Perspectives». Trends in Genetics (en inglés) 32 (2): 101-113. ISSN 0168-9525. PMID 26732754. doi:10.1016/j.tig.2015.12.001. Consultado el 30 de abril de 2021. 
  22. ↑ Laufer, Benjamin I.; Singh, Shiva M. (17 de septiembre de 2015). «Strategies for precision modulation of gene expression by epigenome editing: an overview». Epigenetics & Chromatin 8 (1): 34. ISSN 1756-8935. PMC 4574080. PMID 26388942. doi:10.1186/s13072-015-0023-7. 
  23. ↑ «Unique CRISPR gene therapy offers opioid-free chronic pain treatment». New Atlas. 11 de marzo de 2021. Consultado el 18 de abril de 2021. 
  24. ↑ Moreno, Ana M.; Alemán, Fernando; Catroli, Glaucilene F.; Hunt, Matthew; Hu, Michael; Dailamy, Amir; Pla, Andrew; Woller, Sarah A. et al. (10 de marzo de 2021). «Long-lasting analgesia via targeted in situ repression of NaV1.7 in mice». Science Translational Medicine (en inglés) 13 (584): eaay9056. ISSN 1946-6234. PMC 8830379. PMID 33692134. doi:10.1126/scitranslmed.aay9056. 
  25. ↑ KAISER, JOCELYN (1 de junio de 2022). «Better than CRISPR? Another way to fix gene problems may be safer and more versatile». www.science.org (en inglés). Consultado el 21 de agosto de 2022. 
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