Microscopio óptico

Microscopio óptico.Descripción:A) ocular, B) objetivo, C) portador del objeto, D) lentes de la iluminación, E) sujección del objeto, F) espejo de la iluminación.

Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas. También se le conoce como microscopio de luz, microscopio fotónico (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce como microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.

Historia del microscopio óptico

• 1608 Zacharias Jansen construye un microscopio con dos lentes convergentes.
• 1611 Kepler sugiere la manera de fabricar un microscopio compuesto.
• 1665 Robert Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeños poros en forma de caja a los que él llamó "células". Publica su libro Micrographia
• 1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observará bacterias por primera vez 9 años después.
• 1828 W. Nicol desarrolla la microscopía con luz polarizada.
• 1838 Schleiden y Schwann proponen la teoría de la célula y declaran que la célula nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales.
• 1849 J. Quekett publica un tratado práctico sobre el uso del microscopio.
• 1876 Abbé analiza los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el microscopio y muestra cómo perfeccionar el diseño del microscopio.
• 1881 Retzius describe gran número de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por ningún otro microscopista de luz. En las siguientes dos décadas él, Cajal y otros histólogos desarrollan nuevos métodos de tinción y ponen los fundamentos de la anatomía microscópica.
• 1886 Zeiss fabrica una serie de lentes, diseño de Abbé que permiten al microscopista resolver estructuras en los límites teóricos de la luz visible.
• 1908 Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.
• 1930 Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de interferencia.
• 1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.
• 1937 Ernst Ruska y Max Knoll, físicos alemanes, construyen el primer microscopio electrónico.
• 1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para el microscopio de luz.

Partes del microscopio óptico y sus funciones

1 * Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplia la imagen formada en los objetivos.

2 * Objetivo: lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. lo que significa que es muy importante este elemento del microscopio,es un elemento vital que permite ver a traves de los oculares

3 * Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

4 * Diafragma: regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

5 * Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

6 * Tubo: es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera.

7 * Revólver: Es un sistema que coge los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro.

8 * Tornillos macro y micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.

9 * Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa.

Sistema de iluminación

La fuente de luz 1, con la ayuda de una lente (o sistema) 2, llamada colector, se representa en el plano del diafragma iris de abertura 5 del condensador 6. Este diagrama se instala en el plano focal anterior del condensador 6 y puede variar su abertura numérica. El diagrama iris 3 dispuesto junto al colector 2 es el diafragma de campo. La variación del diámetro del diafragma de campo permite obtener su imagen igual al campo visual lineal del microscopio. La abertura numérica del condensador 6 supera, generalmente la de la abertura del objetivo microscópico.

Microscopio óptico compuesto

Véase Microscopio compuesto.

Sistema óptico

• Ocular: Lente situado cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.

• Objetivo: Lente situado cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.

• Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

• Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

• Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecánico

• Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

• Platina: Lugar donde se deposita la preparación.

• Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, …..

• Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.

• Tornillos de enfoque: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

Manejo del microscopio óptico

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4. Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

6. Empleo del objetivo de inmersión:

a. Bajar totalmente la platina.

b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.

c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.

d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.

f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.

g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.

i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.

j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

Mantenimiento y precauciones

1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

3. Nunca hay que tocar los lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.

5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol . No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).

7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.

8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.

9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

Principales elementos de un microscopio básico

Diagrama simple de la óptica de un microscopio.

Los microscopios de este tipo suelen ser más complejos, con varias lentes en el objetivo como en el ocular. El objetivo de éstas lentes es el de reducir la aberración cromática y la aberración esférica. En los microscopios modernos el espejo se sustituye por una lámpara que ofrece una iluminación estable y controlable.

Los microscopios compuestos se utilizan para estudiar especímenes delgados, puesto que su profundidad de campo es muy limitada. Por lo general, se utilizan para examinar cultivos, preparaciones trituradas o una lámina muy fina del material que sea. Normalmente depende de la luz que atraviese la muestra desde abajo y usualmente son necesarias técnicas especiales para aumentar el contraste de la imagen.

La resolución de los microscopios ópticos está restringida por un fenómeno llamado difracción que, dependiendo de la apertura numérica (AN o $A_{N}$) del sistema óptico y la longitud de onda de la luz utilizada ($\lambda$), establece un límite definido ($d$) a la resolución óptica. Suponiendo que las aberraciones ópticas fueran despreciables, la resolución sería:

$\delta ={\frac {\lambda }{2*A_{N}}}$

Normalmente, se supone una $\lambda$ de 550 nm, correspondiente a la luz verde. Si el medio es el aire, la $A_{N}$ práctica máxima es de 0,95, y en el caso de aceite de hasta 1,5.

Ello implica que incluso el mejor microscopio óptico está limitado a una resolución de unos 0,2 micrómetros.

Poder separador, objetivos de inmersión y aumento útil

• Poder separador

De la teoría de la difracción sobre la formación de imágenes mediante un microscopio se tiene que la distancia mínima entre dos puntos visibles por separado es:

$\delta ={\frac {\lambda }{2*A_{N}}}$

Donde λ es la longitud de onda de la luz monocromática en la que se observa el objeto y A es la abertura del microscopio.

• Objetivos de inmersión

El medio óptico líquido que rellena el espacio entre el objeto y el objetivo se le denomina líquido de inmersión. El índice de refracción de este es próximo al del vidrio (se utiliza agua, glicerina, aceites cedral y de enebro, monobromonaftalina, etc.) En la figura se muestra el papel del líquido.

Archivo:Inmersion110.jpg

Medio de inmersión que rellena el espacio entre el objeto y el objetivo.

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Correcciones

• Tipos de objetivos y sus características.

Aunque todos los componentes que constituyen un microscopio son importantes, los objetivos son de suma importancia, puesto que la imagen, en definitiva, depende en gran medida de su calidad. Los mejores objetivos son aquellos que están corregidos para las aberraciones

• ¿Qué son las aberraciones?

Son alteraciones ópticas en la formación de la imagen debidas a las propias lentes del objetivo.

• aberraciones geométricas
• aberraciones cromáticas

• ¿Cómo se corrigen las aberraciones?

Para evitar las aberraciones geométricas se construyen los llamados objetivos planos o planáticos, lo cual suele estar indicado en el propio objetivo con la inscripción PLAN. Los objetivos que están corregidos para las aberraciones cromáticas se denominan acromáticos (corregidos para el rojo y el azul), semiapocromáticos (corregidos para el rojo y el azul y tienen una mayor apertura numérica) y finalmente los apocromáticos (que son de mayor calidad y están corregidos para el rojo, el azul y el verde).

Aplicaciones del microscopio óptico

Este instrumento ha sido de gran utilidad, sobre todo en los campos de la ciencia en donde la estructura y la organización microscópica es importante, incorporándose con éxito a investigaciones dentro del área de la química (en el estudio de cristales), la física (en la investigación de las propiedades físicas de los materiales), la geología (en el análisis de la composición mineralógica de algunas rocas) y, por supuesto, en el campo de la biología (en el estudio de estructuras microscópicas de la materia viva), por citar algunas disciplinas de la ciencia.

Hasta ahora se da uso en el laboratorio de histología y anatomía patológica, donde la microscopía permite determinadas aplicaciones diagnósticas, entre ellas el diagnóstico de certeza del cáncer, numerosas estructuras cristalinas, pigmentos, lípidos, proteínas, depósitos óseos, depósitos de amiloide, etcétera.

Microscopio estereoscópico

Microscopio estereoscópico

El diseño de este instrumento es distinto al del diagrama de más arriba y su utilidad es diferente, pues se utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios estereoscópicos, por definición, deben ser binoculares (con un ocular para cada ojo), por lo que a veces se confunden ambos términos. Existen dos tipos de diseño, denominados respectivamente convergente (o Greenough) y de objetivo común (o Galileo).

El diseño convergente consiste en usar dos microscopios idénticos inclinados un cierto ángulo uno con respecto a otro y acoplados mecánicamente de tal forma que enfocan la imagen en el mismo punto y con el mismo aumento. Aunque es un diseño económico, potente y en el que las aberraciones resultan muy fáciles de corregir, presenta algunas limitaciones en cuanto a modularidad (capacidad de modificar el sistema para poner accesorios) y la observación durante tiempos largos resulta fatigosa.

El microscopio estereoscópico es apropiado para observar objetos de tamaños relativamente grandes, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver, (laminar) ni tampoco lo es que la luz pase a través de la muestra. Este tipo de microscopios permite una distancias que van desde un par de centímetros a las decenas de ellos desde la muestra al objetivo, lo que lo hace muy útil en botánica, mineralogía y en la industria (microelectrónica, por ejemplo) como en medicina (microscopios quirúrgicos) e investigación, fundamentalmente en aplicaciones que requieren manipular el objeto visualizado (donde la visión estereoscópica es esencial). En la fotografía se aprecia una concha de 4 cm de diámetro.

Podríamos decir que un microscopio estereoscópico sirve para las disecciones de animales.

Conectar una cámara digital a un microscopio óptico

Adaptador digital LM para la Canon EOS 5D

Un adaptador óptico mecánico es importante en fotografía digital. Dicho adaptador sirve de enlace entre la cámara y el microscopio. Es especialmente importante que la conexión mecánica sea firme, pues cualquier movimiento mínimo, es decir, vibraciones de la cámara, reduciría la calidad de la imagen notablemente. Adicionalmente, se requiere un adaptador óptico para el trayecto de luz con el que se logrará así que el sensor CCD/CMOS de la cámara proyecte una imagen de total nitidez e iluminación.

La fotomicrografía (fotografía realizada con la ayuda de un microscopio compuesto) es un campo muy especializado de la fotografía, para la que hay disponibles equipos de precio muy elevado, y no simples equipos de estudio.

Con un microscopio de calidad adecuada, como los que se encuentran en la mayoría de los laboratorios científicos, se pueden realizar fotomicrografías de una calidad razonable, utilizando una cámara de uso general, de objetivo fijo o intercambiable.

Métodos básicos

Hay dos métodos básicos de tomar fotografías por medio del microscopio. En el primer método el objetivo de la cámara realiza una función parecida a la del cristalino del ojo y proyecta sobre el sensor una imagen real de la imagen virtual que se ve por el ocular del microscopio. Este método es el único adecuado para utilización de cámaras con objetivo fijo, esto es, no intercambiable.

El segundo método, adecuado para cámaras con objetivo intercambiable, implica retirar el objetivo de la cámara y ajustar el microscopio de modo que el ocular forme una imagen directamente sobre el sensor.

La calidad de la óptica de un microscopio (objetivo y ocular) es fundamental en la determinación de la calidad de una imagen fotográfica. Los objetivos y oculares de microscopio se encuentran en diferentes calidades, determinadas por la precisión con que han sido corregidos de aberraciones. Los objetivos más económicos están corregidos de aberración esférica para un solo color, generalmente el amarillo verdoso, pero no de aberración cromática para la totalidad del espectro visible, sino sólo para dos o tres colores, primarios. Estos objetivos se llaman acromáticos, y también muestran cierta cantidad de curvatura de campo; esto es, que la totalidad del campo de visión del objetivo no puede llevarse simultáneamente a foco fino.

Existen los acromáticos de campo plano, en los que la curvatura de campo ha sido casi totalmente corregida, se denominan planacromáticos.

Los apocromáticos están corregidos de aberración esférica para dos colores y de aberración cromática para los tres colores primarios. Aun así, mostrarán curvatura de campo a menos que sean planapocromáticos, los mejores objetivos de que se dispone. Los oculares también tienen diferentes calidades. Los más simples son los de campo ancho.

Los oculares compensadores se diseñan para compensar ciertas aberraciones cromáticas residuales del objetivo, y dan su mejor resultado cuando se utilizan con objetivos apocromáticos, aunque también pueden utilizarse con éxito con los acromáticos de mayor potencia. Existen los oculares foto, especiales para fotomicrografía, y cuando se utilizan con los objetivos planapocromáticos dan la mejor calidad posible de fotografía.

Desor

El diseño de objetivo común utiliza dos rutas ópticas paralelas (una para cada ojo) que se hacen converger en el mismo punto y con un cierto ángulo con un objetivo común a ambos microscopios. El diseño es más sofisticado que el convergente, con mejor modularidad y no genera fatiga en tiempos de observación largos. Sin embargo es más costoso de fabricar y las aberraciones, al generarse la imagen a través de la periferia del objetivo común y en un ángulo que no coincide con el eje óptico del mismo, son más difíciles de corregir.

Los microscopios estereoscópicos suelen estar dotados, en cualquiera de sus variantes, de un sistema pancrático (zoom) o un sistema de cambiador de aumentos que permite observar la muestra en un rango de aumentos variable, siempre menor que el de un microscopio compuesto.