Transfección

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La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos u otras herramientas para la transferencia. El término transfección para métodos no virales se usa en referencia a células de mamífero, mientras que el término transformación se prefiere para describir las transferencias no virales de material genético en bacterias y células eucariotas en animales como hongos, algas o plantas.[1]

La transfección de células animales generalmente se lleva a cabo abriendo poros o "agujeros" transitorios en la membrana plasmática de las células mediante electroporación, para permitir el paso del material genético (como construcciones de DNA superenrollado o siRNA) aunque pueden ser transfectadas incluso proteínas (como anticuerpos, por ejemplo). Además de la electroporación, se pueden utilizar otras técnicas para efectuar la transfección, como por ejemplo liposomas producidos mediante la mezcla de lípidos catiónicos con el material genético, que se fusionarán con la membrana plasmática celular y depositarán su carga adentro.

Archivo:Transfección en células animales.png
Transfección en células animales Foto obtenida de: Josh Roberts, 7 de junio de 2004

El significado original de "transfección" era "infección por transformación", es decir, introducción de DNA o RNA desde un virus procariótico ó bacteriófago en las células, resultando en una infección. Al tener el término transformación otro sentido en biología celular animal (un cambio genético que permite la propagación durante largos periodos de células en cultivo, o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerígenas), el término transfección adquirió, para células animales, su actual significado de cambio en las propiedades celulares por la introducción de material genética.[2]

Métodos Químicos[3] [editar]

Basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorpora, ya sea directo mediante la ruta endocítica o a las membranas.

  • Método del fosfato cálcico: Basado en la formación de un precipitado, entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos; estos forman unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares.
  • Método del DEAE dextrano: Basado en la obtención de complejos entre la resina y DEAE y el DNA, los polímeros del DEAE dextrano tienen una carga que les permite unirse a las cargas muy negativas de las moléculas del DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerina.
  • Método de lipofección: Se basa en la formación de complejos entre lípidos catónicos y DNA, este complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el cito-sol; una de las vías es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap.

Métodos Físicos[2] [editar]

Basados en la introducción mecánica de las moléculas en el interior de la célula.

  • Micro-inyección directa: Se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos, esta técnica es muy efectiva pero laboriosa.
  • Electroporación: introducción del DNA adherido a micro-partículas que se disparan sobre la célula.

Transfección estable[editar]

Para la generación de líneas celulares estables el transgen de interés debe ser co-transfectado con un marcador de selección que produzca resistencia a una droga. Para cada ensayo de transfección estable se debe monitorear de manera cuidadosa la integración del transgen en el genoma de la célula blanco. El método más utilizado en la investigación clínica para lograr una transfección estable es el de la transfección mediada por virus, también conocida como transducción. Este método es altamente eficiente debido a la naturaleza viral de la integración en el genoma del huésped. Por ejemplo, se ha utilizado el virus de la leucemia murine (MLV) como vector viral para establecer la expresión sostenible de genes de interés en humanos. El MLV integra su DNA en el genoma del hospedero, el cual es posteriormente expresado. El DNA del MLV integrado se replica con el genoma del hospedero, lo que permite la expresión sostenible del gen de interés.[4]

Experimentación de la transfección estable[editar]

En un experimento de transfección típico se debe permitir a las células recuperarse de la transfección por un periodo de 24 a 72 horas en la ausencia de selección. Esto permite a la célula expresar la cantidad necesaria de la enzima de resistencia para proteger a las células transfectadas establemente contra la droga. Después de 48 o 72 horas de la transfección el medio de cultivo debe ser cambiado y reemplazado con medio nuevo complementado con la droga. La selección se produce dentro de las primera a las tercera semana posterior a la transfección con cambios frecuentes del medio de cultivo selectivo. Finalmente la integridad y número de copias del gen debe ser determinado por Southern Blot.[5]

Transfección transitoria[editar]

La transfección transitoria de genes está sujeta a varios parámetros. El método de transfección, la fisiología celular, el método enzimático o colorimétrico utilizado para cuantificar la actividad del gen reportero, la cantidad de DNA y la normalización de la data. El período de expresión del gen en una transfección génica que varía entre 24 a 72 horas y para el éxito del procedimiento son críticas las condiciones celulares, con las células saludables y las que se encuentren en división las más susceptibles a aceptar plásmidos recombinantes. Para determinar la eficiencia y reproducibilidad de la transfección se puede utilizar un segundo gen reportero que exprese un producto génico que pueda ser detectado y medido de manera sencilla. Tal gen reportero no debe estar presente en el genoma del tipo celular o, en el peor de los casos, puede estar presente pero debe ser expresado en bajos niveles. Es importante recalcar que la eficiencia en la expresión del gen reportero disminuye drásticamente con la integridad del plásmido y su habilidad por llegar al núcleo. Los métodos de transfección transitoria generalmente dirigen el DNA plasmático al citoplasma y no está claro qué porcentaje de estas moléculas son lineales o circulares los alcanzan el núcleo celular. Además, los parámetros experimentales deben ser definidos con cuidado para lograr cierto grado de reproducibilidad. Se ha sugerido que entre los diferentes mecanismos, la difusión pasiva de los plásmidos a través del citoplasma y los poros nucleares representa la forma más probable por la cual los genes reporteros pueden migrar al núcleo celular y ser activados transcripcionalmente. Sin embargo, existe evidencia que sugiere otro mecanismo para explicar la transferencia del DNA plasmático al núcleo celular, basándose en señales de importación del DNA. Se piensa que existe una interacción proteína-DNA plasmático en el citoplasma y que tales interacciones, con factores de transcripción producen señales de localización nuclear, permitiendo la importación de DNA exógeno al núcleo.[6]

Transfección en microorganismos[7] [editar]

Con el fin de dar origen a un centro infectivo, una bacteria debe poseer, al menos un genoma fágico completo; en el caso de esta infección este genoma se consigue por inyección de DNA o RNA en el interior de la célula receptora valiéndose el fago para ello de un complicado mecanismo, en cambio en virus pequeños se da por penetración de la partícula completa. En cuanto a la transfección, la barrera natural que ofrece la pared y la membrana bacteriana a la penetración de las macro-moléculas de ácido nucleico eléctricamente cargadas, requiere una previa preparación de las células receptoras; en síntesis se pueden distinguir dos sistemas fundamentales de transfección que son los siguientes:

Transfección de células competentes[editar]

Se emplea ácido nucleico vírico, purificado e intacto, como material donador, mientras que las células receptoras deben poseer un estado fisiológico especial llamado estado de competencia; por tanto, el término célula competente para transfección se refiere a aquella célula que permite la entrada y replicación del ácido nucleico vírico, así como la formación y liberación de las partículas víricas que darán origen al centro infectivo.

Transfección medida por un virus auxiliar[editar]

transfección de microorganismos

En este sistema la entrada de DNA vírico requiere una infección adicional con un fago intacto, este fago esta constantemente mutando en alguna función biológica esencial, lo que trae como consecuencia que su replicación esté total o casi totalmente bloqueada.Este sistema fue descrito por Kaiser y Hogness para el fago Lambda; para la transfección se requiere la asociación entre el DNA transfectante y el DNA del virus auxiliar, su eficiencia depende de la multiplicidad de infección (MOI) del virus auxiliar.

Interés biológico de la Transfección[editar]

La aplicación mas interesantes es el rescate de marcadores empleado para estudiar la genética de los bacteriófagos; esta técnica consiste en adicionar a un cultivo bacteriano competente un bacteriófago con una mutación en su genoma, y después de su adsorción del DNA fágico añadir al cultivo DNA transfectante procedente de un bacteriófago silvestre. De este modo los genomas de los fagos silvestres de la descendencia provendrán de la recombinación de los dos DNA víricos.

Se ha demostrado que el empleo de combinado de la transfección con el rescate de marcadores es un método útil para la titulación de genes, lo cual permite determinar la proporción relativa de varios marcadores genéticos durante la síntesis de DNA fágico.[8]

Referencias[editar]

  1. Nota Técnica (15-07-2006). «Transfección». Cultek. Consultado el 03-03-2017. 
  2. a b Iglesias, Juan; Villamonte, Gianfranco; Gonzales, Mauricio (2015). «Transfección de ADN de células de animales». ISSN version en linea 1994-9073. Consultado el 03-03-2017. 
  3. Pietrasanta, Lia (2001). «Tópicos en biofisica moleular». Consultado el 03-03-2017. 
  4. Cortázar, Tania; Walker, John. (2004). «Manipulación genética y el estudio del parásito protozoario Leishmania». Consultado el 04-03-2017. 
  5. Lodish, Harvey (2005). «Biologia celular y moleular». Editorial Médica panamericana. Consultado el 04-03-2017. 
  6. Castro, Fidel; Portelles, Yangtse. (1997). «Transfección de ADN a células de mamíferos». Consultado el 04-03-2017. 
  7. Jiménez, Guerrero, Alfonso, Ricardo (1982). Genética molecular bacteriana. España: Reverté S.A. Consultado el 05-03-2017. 
  8. Armenta, Valera, Martínez (2006). «Transfección de células por medio de ondas de choque». Consultado el 05-03-2017.