Test de dispersión de la cromatina espermática

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Test de dispersión de la cromatina espermática (SCD: Sperm Chromatin Dispersion Test)[editar]

La integridad del material genético del espermatozoide, al igual que su concentración, motilidad y morfología, es un parámetro adicional que ayuda a evaluar la calidad de una muestra seminal. La presencia de roturas en la cadena del ADN del espermatozoide se conoce como “fragmentación del ADN espermático”. Cuando esto ocurre, las posibilidades de obtener un embarazo a término son menores. El test SCD (Sperm Chromatin Dispersion) es una técnica empleada para identificar y evaluar los espermatozoides que presentan daño en su ADN. Es decir, permite identificar aquellos espermatozoides que tienen su material genético (ADN) dañado y así diferenciarlos de los que no lo tienen.

Existen diversas causas que provocan daño en el ADN espermático. Entre las principales están: fallo en la reparación de nicks en el ADN, ataque de ROS (especies reactivas de oxígeno) al ADN y escasez de puentes disulfuro debido a un empaquetamiento alterado del ADN.

Este test permite establecer la proporción de espermatozoides con ADN fragmentado en el total de muestra analizada (índice de fragmentación; IF: proporción de espermatozoides con ADN fragmentado con respecto al total de espermatozoides analizados). El cálculo del IF en los pacientes es una información valiosa para seleccionar el método de reproducción asistida más eficaz para cada uno de ellos. Se estima que utilizando métodos de reproducción normales, un porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado superior al 30 % reduce o en algunos casos elimina la posibilidad de conseguir en embarazo a término (Evenson 2008). En estos casos, se aconseja el empleo de la técnica de fertilización in vitro (FIV) o la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) donde se requiere una selección eficaz del espermatozoide que se utilizará para fertilizar el oocito. Las parejas que presentan infertilidad y con porcentajes menores a un 30% de espermatozoides con ADN fragmentado, se les aconseja el empleo de la técnica de inseminación intrauterina (IUI), que es la más natural, fácil y económica, a diferencia de las anteriormente mencionadas. Desde esta perspectiva, el test SCD complementa el estudio de la calidad seminal y posibilita la selección directa del mejor método de reproducción asistida cuando no existe factor femenino que condicione la fertilidad y evita el realizar ciclos con posibilidades de fallo de inseminación o bien de correcto desarrollo embrionario.

1. Base de la técnica SCD[editar]

La base técnica de la prueba de SCD se basa en dos fenómenos: el primero es que las hebras de ADN que contienen roturas en su ADN son más fáciles de ser desnaturalizadas utilizando esos puntos de rotura. De hecho, los extremos de las roturas, que pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble, son los orígenes de la desnaturalización cuando éstos se enfrentan a un tratamiento de carácter ácido. El segundo fenómeno es que los bucles compactados de fibra de cromatina nuclear, compuestas de ADN y proteínas, se desempaquetan cuando se extraen proteínas nucleares. Este proceso de relajación de los bucles de cromatina tras un tratamiento desproteinizante da lugar a halos periféricos de cromatina/ADN que emanan del residuo nuclear central, según el modelo propuesto por Cook y Brazell en 1980.

Imagen al microscopio óptico de espermatozoides sometidos a desnaturalización con una solución de lisis

La prueba de SCD ha sido adaptada para visualizar el daño en los espermatozoides humanos y la metodología consta de tres pasos principales: (1) inclusión de los espermatozoides en una matriz inerte semisólida, tipo agar, sobre un portaobjetos, (2) incubación de la muestra en un medio ácido para provocar la desnaturalización del ADN, (3) tratamiento de los espermatozoides sometidos a desnaturalización con una solución de lisis para eliminar de forma controlada las proteínas nucleares. Las preparaciones obtenidas de esta forma, se fijan y deshidratan en una serie de alcoholes (etanol al 70%, 90% y 100%) para proceder posteriormente a una tinción que se observa bajo el microscopio óptico tanto de campo claro (Figura a) como de fluorescencia (Figura b). Una vez realizada la técnica, podemos observar tres tipos de espermatozoides:


- No fragmentados. En ellos se forma un halo característico de dispersión de los bucles de ADN en torno a un núcleo denso central.

- Fragmentados. Los halos no aparecen o bien son de un tamaño muy reducido.

- Degradados. Espermatozoides sin halo, con núcleo desorganizado.


Este comportamiento diferencial de la cromatina es la base del test SCD. La fácil y clara discriminación entre los tres tipos de espermatozoides permite, en algunos casos, establecer un posible diagnóstico clínico sobre algunas patologías relacionadas con el aparato reproductor masculino. Así, la presencia de niveles altos de espermatozoides degradados se encuentra asociada a un síndrome, bastante común y muchas veces no diagnosticado, como es el varicocele (Enciso et al. 2006, García Peiró et al. 2011).


La técnica de SCD se puede usar también para el estudio de muestras seminales de otros mamíferos, peces o insectos, pero en todos los casos los protocolos de desproteinización han de ser adaptados a cada especie, dado que las proteínas que intervienen en el empaquetamiento del ADN tienen diferente naturaleza. (Johnston et al 2009, López-Fernández et al 2009, Zee et al. 2009, López-Fernández et al. 2010, Pérez-Llano et al. 2010, González-Marín et al. 2011).

2. Aplicaciones de la técnica SCD[editar]

1) Análisis de la frecuencia de espermatozoides con ADN fragmentado. (Fernández et al.2005, Fernández et al.2011, García Peiró et al. 2011)

2) Análisis simultáneo de daño en el ADN y presencia de aneuploidías. (Muriel et al, 2007)

3) Análisis simultáneo de daño en el ADN y de 8-oxoguanosina, provocados por estrés oxidativo. (Santiso et al. 2010)

4) Análisis simultáneo de daño en el ADN y metilación de residuos de citosina.

5) Análisis simultáneo de daño en el ADN y cambios en la matriz proteica del espermatozoide. (de la Torre et al. 2007)

6) Técnica de elección en situaciones de oligospermia severa.

7) Selección de donantes de semen (Gosálvez et al. 2009)

8) Control de calidad de las técnicas de laboratorio de andrología.

9) Diagnóstico y seguimiento de varicocele. (Enciso et al. 2006, García Peiró et al. 2011)

10) Evaluación del impacto de infecciones bacterianas del tracto genitourinario. (Gallegos et al. 2008, González-Marín et al. 2011)

11) Evaluación del efecto de agentes tóxicos: tabaco, pesticidas, etc. (Viloria et al. 2007)

12) Estudios dinámicos de la evolución de la pérdida de calidad del ADN espermático. (López-Fernández et al. 2007, 2010, García Peiró et al. 2011)


3. Comparativa con otras técnicas[editar]

Los resultados del test SCD se correlacionan con los obtenidos con otro tipo de técnicas para analizar la fragmentación del ADN en el espermatozoide. Entre ellas, las más comunes son el TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase -TdT-mediated nick-end labelling), el Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) y el ensayo de Cometa (Chohan et al. 2006, García-Macías et al. 2007, Vélez de la Calle et al. 2008, Zhang et al. 2010). Las ventajas e inconvenientes de cada una ella de ellas se recogen en la tabla 1.

TÉCNICA VENTAJAS INCONVENIENTES
TUNEL - Requiere pocos espermatozoides

- Evaluación mediante microscopía de fluorescencia o de campo claro, o mediante citometría

- Disponible en kits

- Protocolos variables con resultados irregulares

- Muy laborioso

Ensayo COMETA - Requiere pocos espermatozoides

- Evaluación mediante microscopía de fluorescencia

- Protocolos variables, con resultados irregulares

- Muy laborioso

- Equipamiento complejo

- Requiere software de análisis complicado

- Preparaciones no permanentes

SCSA - Larga experiencia

- Correlaciones clínicas bien establecidas

- Análisis mediante citometría

- Requiere equipamiento costoso

- Resultado sensible a pequeñas variaciones externas

- Requiere muchos espermatozoides

- Preparaciones no permanentes

SCD - Requiere pocos espermatozoides

- Requiere equipamiento muy básico

- Simple y rápido de ejecución

- Evaluación mediante microscopía de campo claro o de fluorescencia, con posibilidad de análisis extensivo automatizado

- Discriminación de diferentes categorías de daño del ADN, especialmente el nivel “degradado”, no reconocible por otros procedimientos

- Preparaciones permanentes, revisables

- Gran versatilidad: posibilidad de estudios simultáneos correlativos de anomalías cromosómicas, 5-metilcitosina, 8-oxoguanina y matriz nuclear residual

- Protocolo único, disponible en kit

Referencias[editar]

1.- Evenson DP, Wixon R (2008). “Data analysis of two in vivo fertility studies using sperm chromatin structure assay derived DNA fragmentation index vs. pregnancy outcome”. Fertil Steril 90(4):1229–31. PMID 18191126.

2.- Cook PR, Brazell IA (1980) “Mapping sequences in loops of nuclear DNA by their progressive detachment from the nuclear cage”. Nucleic Acids Res 8(13): 2895-906. PMID 7433096.

3.- Enciso M, Muriel L, Fernández JL, Goyanes V, Segrelles E, Marcos M, Montejo JM, Ardoy M, Pacheco A, Gosálvez J (2006). “Infertile men with varicocele show a high relative proportion of sperm cells with intense nuclear damage level, evidenced by the sperm chromatin dispersion test”. J Androl 27(1):106-111. PMID 16400086.

4.- García-Peiró A, Martínez-Heredia J, Oliver-Bonet M, Abad C, Amengual MJ, Navarro J, Jones C, Coward K, Gosálvez J, Benet J (2011) “Protamine 1 to protamine 2 ratio correlates with dynamic aspects of DNA fragmentation in human sperm”. Fertil Steril 95(1): 105-109. PMID 21535010.

5.- Johnston SD, López-Fernández C, Gosálbez A, Holt WV, Gosálvez J (2009). “Directional mapping of DNA nicking in ejaculated and cauda epididymidal spermatozoa of the short-beaked echidna (Tachyglossus aculeatus: Monotremata)”. Reprod Fertil Dev 21(8):1008-1014. PMID 19874725.

6.- López-Fernández C, Gage MJ, Arroyo F, Gosálbez A, Larrán AM, Fernández JL, Gosálvez J (2009). “Rapid rates of sperm DNA damage after activation in tench (Tinca tinca: Teleostei, Cyprinidae) measured using a sperm chromatin dispersion test.” Reproduction 138(2): 257-266 PMID 19494044.

7.- Zee YP, López-Fernández C, Arroyo F, Johnston SD, Holt WV, Gosalvez J (2009) “Evidence that single-stranded DNA breaks are a normal feature of koala sperm chromatin, while double-stranded DNA breaks are indicative of DNA damage”. Reproduction 138(2): 267-78. PMID 19494045.

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12.- Fernández JL, Cajigal D, López-Fernández C, Gosálvez J (2011). “Assessing sperm DNA fragmentation with the sperm chromatin dispersion test”. Methods Mol Biol. 682:291-301. Human Press. Springer New York, Dordrecht, Heidelberg, London. PMID 21057936.

13.- Muriel L, Goyanes V, Segrelles E, Gosálvez J, Álvarez JG, Fernández JL (2007). “Increased aneuploidy rate in sperm with fragmented DNA as determined by the sperm chromatin dispersion (SCD) test and FISH analysis”. J Androl 28(1):38-49. PMID 16899813.

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17.- Gallegos G, Ramos B, Santiso R, Goyanes V, Gosálvez J, Fernández JL (2008) “Sperm DNA fragmentation in infertile men with genitourinary infection by Chlamydia trachomatis and Mycoplasma” Fertil Steril 90(2):328-34. PMID 17953955.

18.- Viloria T, Garrido N, Fernández JL, Remohí J, Pellicer A, Meseguer M (2007) “Sperm selection by swim-up in terms of deoxyribonucleic acid fragmentation as measured by the sperm chromatin dispersion test is altered in heavy smokers”. Fertil Steril 88(2):523-525. PMID 17482608.

19.- López-Fernández C, Crespo F, Arroyo F, Fernández JL, Arana P, Johnston SD, Gosálvez J (2007). “Dynamics of sperm DNA fragmentation in domestic animals II. The stallion”. Theriogenology 68(9):1240-1250. PMID 17919715.

20.- Chohan KR, Griffin JT, Lafromboise M, De Jonge CJ, Carrell DT (2006). “Comparison of chromatin assays for DNA fragmentation evaluation in human sperm”. J Androl 27(1):53-59. PMID 16400078.

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22.- Vélez de la Calle JF, Muller A, Walschaerts M, Clavere JL, Jiménez C, Wittemer C, Thonneau P (2008). “Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as assessed by the sperm chromatin dispersion test in assisted reproductive technology programs: results of a large prospective multicenter study” Fertil Steril 90(5):1792-1799. PMID 18166175.

23.- Zhang LH, Qiu Y, Wang KH, Wang Q, Tao G, Wang LG (2010). “Measurement of sperm DNA fragmentation using bright-field microscopy: comparison between sperm chromatin dispersion test and terminal uridine nick-end labeling assay”. Fertil Steril 94(3):1027-1032. PMID 19505686.

• Patents EP1710320, US2007281298. Other countries patents pending.