Pirosecuenciación

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La pirosecuenciación o secuenciación 454, de 454 Life Sciences, es una tecnología que permite determinar una secuencia de ADN a gran escala, aplicable a genomas completos, mediante luminiscencia. Esta técnica es muy rápida y más barata que la secuenciación por el método de Sanger. La pirosecuenciación se diferencia del método de Sanger en que se basa en la detección de la liberación de pirofosfato cuando se incorporan los nucleótidos, mientras que en la segunda la detección se da por la terminación de la cadena con didesoxinucleótidos.

Fundamentos - Luminiscencia[editar]

En este caso no se añaden los nucleótidos juntos como en una reacción de secuenciación normal, sino uno después del otro. Si el nucleótido añadido al medio de reacción corresponde al que necesita la polimerasa, se incorpora a la cadena que se está sintetizando (elongamiento) y se libera un pirofosfato. A continuación, una ATP sulfurilasa transforma este pirofosfato (PPi) en ATP, que se acoplará a la luciferina, formando un complejo que será utilizado por una luciferasa. Como resultado se produce oxiluciferina y una señal luminosa. Finalmente, una apirasa se encarga de degradar aquellos nucleótidos que no han sido incorporados y quedan sueltos con el fin de que al añadir un nuevo dNTP, no existan restos de reacciones anteriores.

Es el secuenciador o más precisamente el sensor CCD, el que captura esta señal lumínica y lo reproduce como un pico en un pirograma. La altura de este pico variará en función de la intensidad de la señal luminosa, que a su vez es proporcional al número de nucleótidos incorporados.

De esta forma se puede deducir la secuencia partiendo del tamaño de los picos obtenidos. Si hay un polimorfismo en una secuencia no habría problemas para detectarlo pues el tamaño de los picos también es proporcional a las cadenas portadoras de un nucleótido u otro.

Procedimiento[editar]

  1. Fragmentar el ADN a secuenciar mediante un proceso conocido como nebulización.
  2. Mediante una emulsión de aceite se generan microesferas, a las que se intenta que esté atado un único fragmento de ADN.
  3. En cada microrreactor se encuentran los elementos necesarios para la reacción de PCR: oligonucleótidos, dNTPs, polimerasa y un único fragmento de ADN molde.
  4. Mediante la amplificación por PCR, se generan muchas copias del mismo fragmento de ADN original.
  5. Después se liberan las cuentas de la emulsión y se colocan en placas donde se procede con la secuenciación. Para realizar la secuenciación se vierte la emulsión sobre una fase sólida con celdillas. En cada una de estas celdas se produce una pirosecuenciación. La secuenciación completa se lleva a cabo añadiendo uno de los cuatro nucelótidos y observando qué celdilla se ilumina. Después de cada adición de nucleótidos se lava y se añade el siguiente nucleótido. Este proceso se repite hasta completar la secuencia.

Aplicaciones[editar]

Es una técnica que se utiliza mucho en el diagnóstico molecular, sobre todo cuando ya se sabe de antemano la secuencia que se desea obtener, aunque también se utiliza para obtener la secuencia de un ADN problema. En el caso de no conocer la secuencia en particular, la máquina va liberando por orden las bases A, T, C, G. El resultado nos otorgará un patrón de picos que tendremos que interpretar. En el caso en que queramos detectar una mutación puntual conociendo de antemano la secuencia, lo que haremos será liberar las bases que sabemos que debe tener nuestra secuencia por orden, y veremos dónde se encuentra la mutación en nuestro paciente. Esto nos permitirá ver si el paciente es homocigoto sano o enfermo, o si es heterocigoto.

Implicaciones[editar]

Su bajo coste y velocidad, que permitió a la compañía secuenciar el código de un adenovirus en 2003 en un sólo día,[1] plantea la posibilidad de secuenciar genomas completos de forma rutinaria, lo cual es de especial interés en biomedicina. De hecho, el genoma de James Watson, codescubridor de la estructura del ADN, fue descrito y publicado mediante esta técnica.[2]

Además, esta técnica se emplea para realizar tipajes de organismos infecciosos y para tipajes HLA.

Ventajas[editar]

Algunas de las ventajas de la pirosecuenciación son que no es necesario usar geles, marcadores fluorescentes o ddNTPs.

Referencias[editar]

  1. Cristina de Martos. «Más cerca de la secuenciación personalizada del ADN». Consultado el 15 de diciembre de 2007. 
  2. «James Watson's Personal Genome Sequence» (en inglés). 

Enlaces externos[editar]