Diferencia entre revisiones de «Gene targeting»

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El ''gene targeting'' permite estudiar un gen, analizando ''[[In vivo|en vivo]]'' cualquier evento biológico que se desarrolla en caso de ausencia o mutación del gen mismo. La aplicación de esta técnica ha tenido y continua teniendo un gran éxito en diversos campos de la investigación biomédica.
El ''gene targeting'' permite estudiar un gen, analizando ''[[In vivo|en vivo]]'' cualquier evento biológico que se desarrolla en caso de ausencia o mutación del gen mismo. La aplicación de esta técnica ha tenido y continua teniendo un gran éxito en diversos campos de la investigación biomédica.
== Metodología ==
== Métodos ==


La metodología para la realización de un ''gene targeting'' varían según el [[organismo modelo|organismo]] utilizado. El ''gene targeting'' sobre el [[Mus musculus]] (el ratón común), por ejemplo, sigue generalmente el siguiente pasaje:
El método para la realización de un ''gene targeting'' varían según el [[organismo modelo|organismo]] utilizado. El ''gene targeting'' sobre el [[Mus musculus]] (el ratón común), por ejemplo, sigue generalmente el siguiente pasaje:
#realización a partir de [[bacteria]]s de una construcción de [[ADN]] intermediario que contiene típicamente parte del gen objetivo, un [[gen de reporte]] y un [[marcador de selección]];
#realización a partir de [[bacteria]]s de una construcción de [[ADN]] intermediario que contiene típicamente parte del gen objetivo, un [[gen de reporte]] y un [[marcador de selección]];
#inserción de esta construcción en el interior de [[célula estaminal|células estaminales embrionarias]] del ratón en [[cultivo celular|cultivo]];
#inserción de esta construcción en el interior de [[célula estaminal|células estaminales embrionarias]] del ratón en [[cultivo celular|cultivo]];
#selección de las células que presentan una inserción correcta, y su inyección en el interior de los tejidos de un [[embrión]] de ratón;
#selección de las células que presentan una inserción correcta, y su inyección en el interior de los tejidos de un [[embrión]] de ratón;
#nacimiento del ratón [[quimera (animal)|quimera]], con contenido genético modificado, y selección de los [[Animal modificado genéticamente|animales genéticamente modificados]].
#nacimiento del ratón [[quimera (animal)|quimera]], con contenido genético modificado, y selección de los [[Animal modificado genéticamente|animales genéticamente modificados]].
En general, el ADN que contiene parte de un gen hacer modificado, un [[gen reportero]] y un marcador seleccionable (dominante) se ensamblan en bacterias.

Para "apuntar" a los genes en el [[Bryophyta sensu stricto|musgo]], el ADN se incuba junto con [[Protoplasto|protoplastos]] recién aislados y con [[polietilenglicol]]. Dado que los musgos son organismos [[Célula haploide|haploides]],<ref>{{Cita publicación|url=https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1438-8677.1998.tb00670.x|título=Development, Genetics and Molecular Biology of Mosses|apellidos=Reski|nombre=R.|fecha=1998-02|publicación=Botanica Acta|volumen=111|número=1|páginas=1–15|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|doi=10.1111/j.1438-8677.1998.tb00670.x}}</ref> los filamentos de musgo ([[protonema]]) pueden examinarse directamente para detectar el objetivo, ya sea mediante el tratamiento con [[Antibiótico|antibióticos]] o con [[Reacción en cadena de la polimerasa|PCR]]. Único entre las [[Plantae|plantas]], este procedimiento de [[genética inversa]] es tan eficiente como en la [[levadura]].<ref>{{Cita publicación|url=https://doi.org/10.1016/S1360-1385(98)01257-6|título=Physcomitrella and Arabidopsis: the David and Goliath of reverse genetics|apellidos=Reski|nombre=Ralf|fecha=1998-06|publicación=Trends in Plant Science|volumen=3|número=6|páginas=209–210|fechaacceso=2023-07-15|issn=1360-1385|doi=10.1016/s1360-1385(98)01257-6}}</ref> La selección de genes se ha aplicado con éxito en bovinos, ovinos, porcinos y varios hongos.

La frecuencia de selección de genes puede mejorarse significativamente mediante el uso de [[Endonucleasa|endonucleasas]] diseñadas,<ref name=":0">{{Cita publicación|url=https://academic.oup.com/nar/article-lookup/doi/10.1093/nar/gkp548|título=Efficient targeting of a SCID gene by an engineered single-chain homing endonuclease|apellidos=Grizot|nombre=Sylvestre|apellidos2=Smith|nombre2=Julianne|fecha=2009-09|publicación=Nucleic Acids Research|volumen=37|número=16|páginas=5405–5419|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=1362-4962|doi=10.1093/nar/gkp548|pmc=PMC2760784|pmid=19584299|apellidos3=Daboussi|nombre3=Fayza|apellidos4=Prieto|nombre4=Jesús|apellidos5=Redondo|nombre5=Pilar|apellidos6=Merino|nombre6=Nekane|apellidos7=Villate|nombre7=Maider|apellidos8=Thomas|nombre8=Séverine|apellidos9=Lemaire|nombre9=Laetitia}}</ref> como las [[nucleasas con dedos de zinc]],<ref>{{Cita publicación|url=https://www.science.org/doi/10.1126/science.1079512|título=Enhancing Gene Targeting with Designed Zinc Finger Nucleases|apellidos=Bibikova|nombre=Marina|apellidos2=Beumer|nombre2=Kelly|fecha=2003-05-02|publicación=Science|volumen=300|número=5620|páginas=764–764|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=0036-8075|doi=10.1126/science.1079512|apellidos3=Trautman|nombre3=Jonathan K.|apellidos4=Carroll|nombre4=Dana}}</ref> endonucleasas dirigidas diseñadas, y nucleasas basadas en efectores TAL diseñados.<ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/nbt.1755|título=A TALE nuclease architecture for efficient genome editing|apellidos=Miller|nombre=Jeffrey C|apellidos2=Tan|nombre2=Siyuan|fecha=2011-02|publicación=Nature Biotechnology|volumen=29|número=2|páginas=143–148|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=1087-0156|doi=10.1038/nbt.1755|apellidos3=Qiao|nombre3=Guijuan|apellidos4=Barlow|nombre4=Kyle A|apellidos5=Wang|nombre5=Jianbin|apellidos6=Xia|nombre6=Danny F|apellidos7=Meng|nombre7=Xiangdong|apellidos8=Paschon|nombre8=David E|apellidos9=Leung|nombre9=Elo}}</ref> Este método se ha aplicado a especies como Drosophila melanogaster,<ref name=":0" /> tabaco,<ref>{{Cita publicación|url=http://link.springer.com/10.1007/s11103-008-9449-7|título=Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc finger nucleases|apellidos=Cai|nombre=Charles Q.|apellidos2=Doyon|nombre2=Yannick|fecha=2009-04|publicación=Plant Molecular Biology|volumen=69|número=6|páginas=699–709|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=0167-4412|doi=10.1007/s11103-008-9449-7|apellidos3=Ainley|nombre3=W. Michael|apellidos4=Miller|nombre4=Jeffrey C.|apellidos5=DeKelver|nombre5=Russell C.|apellidos6=Moehle|nombre6=Erica A.|apellidos7=Rock|nombre7=Jeremy M.|apellidos8=Lee|nombre8=Ya-Li|apellidos9=Garrison|nombre9=Robbi}}</ref><ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/nature07845|título=High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases|apellidos=Townsend|nombre=Jeffrey A.|apellidos2=Wright|nombre2=David A.|fecha=2009-05|publicación=Nature|volumen=459|número=7245|páginas=442–445|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=0028-0836|doi=10.1038/nature07845|pmc=PMC2743854|pmid=19404258|apellidos3=Winfrey|nombre3=Ronnie J.|apellidos4=Fu|nombre4=Fengli|apellidos5=Maeder|nombre5=Morgan L.|apellidos6=Joung|nombre6=J. Keith|apellidos7=Voytas|nombre7=Daniel F.}}</ref> maíz,<ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/nature07992|título=Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases|apellidos=Shukla|nombre=Vipula K.|apellidos2=Doyon|nombre2=Yannick|fecha=2009-05|publicación=Nature|volumen=459|número=7245|páginas=437–441|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=0028-0836|doi=10.1038/nature07992|apellidos3=Miller|nombre3=Jeffrey C.|apellidos4=DeKelver|nombre4=Russell C.|apellidos5=Moehle|nombre5=Erica A.|apellidos6=Worden|nombre6=Sarah E.|apellidos7=Mitchell|nombre7=Jon C.|apellidos8=Arnold|nombre8=Nicole L.|apellidos9=Gopalan|nombre9=Sunita}}</ref> células humanas,<ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/nature03556|título=Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases|apellidos=Urnov|nombre=Fyodor D.|apellidos2=Miller|nombre2=Jeffrey C.|fecha=2005-06|publicación=Nature|volumen=435|número=7042|páginas=646–651|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=1476-4687|doi=10.1038/nature03556|apellidos3=Lee|nombre3=Ya-Li|apellidos4=Beausejour|nombre4=Christian M.|apellidos5=Rock|nombre5=Jeremy M.|apellidos6=Augustus|nombre6=Sheldon|apellidos7=Jamieson|nombre7=Andrew C.|apellidos8=Porteus|nombre8=Matthew H.|apellidos9=Gregory|nombre9=Philip D.}}</ref> [[Mus (animal)|ratones]]<ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/nbt.1731|título=Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases|apellidos=Cui|nombre=Xiaoxia|apellidos2=Ji|nombre2=Diana|fecha=2011-01|publicación=Nature Biotechnology|volumen=29|número=1|páginas=64–67|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=1087-0156|doi=10.1038/nbt.1731|apellidos3=Fisher|nombre3=Daniel A|apellidos4=Wu|nombre4=Yumei|apellidos5=Briner|nombre5=David M|apellidos6=Weinstein|nombre6=Edward J}}</ref> y [[Rattus|ratas]].<ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/nbt.1731|título=Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases|apellidos=Cui|nombre=Xiaoxia|apellidos2=Ji|nombre2=Diana|fecha=2011-01|publicación=Nature Biotechnology|volumen=29|número=1|páginas=64–67|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=1087-0156|doi=10.1038/nbt.1731|apellidos3=Fisher|nombre3=Daniel A|apellidos4=Wu|nombre4=Yumei|apellidos5=Briner|nombre5=David M|apellidos6=Weinstein|nombre6=Edward J}}</ref>

== Comparación con otras formas de ingeniería genética ==
La relación entre la selección de genes, la edición de genes y la modificación genética se describe en el siguiente diagrama de Venn. Se muestra cómo la "ingeniería genética" abarca las tres de estas técnicas. La edición del genoma se caracteriza por realizar pequeñas ediciones en el genoma en una ubicación específica, a menudo después del corte de la región de ADN objetivo por una nucleasa específica del sitio como CRISPR. La modificación genética generalmente describe la inserción de un [[transgén]] (ADN extraño, es decir, un gen de otra especie) en una ubicación aleatoria dentro del genoma. La orientación genética es una herramienta biotecnológica específica que puede conducir a pequeños cambios en el genoma en un sitio específico, en cuyo caso las ediciones causadas por la orientación genética contarían como edición del genoma. Sin embargo, la selección de genes también es capaz de insertar genes completos (como transgenes) en el sitio de destino si el transgén se incorpora a la plantilla de reparación de homología que se usa durante la selección de genes. En tales casos, las ediciones causadas por la orientación genética se considerarían, en algunas jurisdicciones, como equivalentes a la modificación genética ya que se ha producido la inserción de ADN extraño.

La selección de genes es una forma específica de herramienta de [[Edición de genoma|edición del genoma]]. Otras herramientas de edición del genoma incluyen la mutagénesis dirigida, la edición básica y la [[edición de calidad]], todas las cuales crean ediciones en el ADN endógeno (ADN ya presente en el organismo) en una ubicación genómica específica.<ref>{{Cita web|url=https://www.synthego.com/blog/genome-editing-techniques|título=Synthego {{!}} Full Stack Genome Engineering|fechaacceso=2023-07-15|sitioweb=www.synthego.com|idioma=en}}</ref><ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/s41587-020-0561-9|título=Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors|apellidos=Anzalone|nombre=Andrew V.|apellidos2=Koblan|nombre2=Luke W.|fecha=2020-07-01|publicación=Nature Biotechnology|volumen=38|número=7|páginas=824–844|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=1087-0156|doi=10.1038/s41587-020-0561-9|apellidos3=Liu|nombre3=David R.}}</ref> Esta naturaleza específica de sitio o "dirigida" de la edición del genoma es típicamente lo que hace que la edición del genoma sea diferente a la "modificación genética" tradicional que inserta un [[transgén]] en una ubicación no específica en el genoma de los organismos, así como la edición de genes haciendo pequeñas ediciones del ADN ya presente en los organismos, frente a la inserción de modificación genética de ADN "extraño" de otra especie.<ref>{{Cita web|url=https://www.isaaa.org/blog/entry/default.asp?BlogDate=5/4/2022|título=What is the Difference Between Genetic Engineering and Gene Editing?|fechaacceso=2023-07-15|sitioweb=Science Speaks|idioma=en}}</ref><ref>{{Cita web|url=https://www.ed.ac.uk/roslin/about/dolly/facts/genetic-modification|título=Genetic modification FAQs|fechaacceso=2023-07-15|fecha=2021-06-25|sitioweb=The University of Edinburgh|idioma=en}}</ref>

Debido a que la edición de genes produce cambios más pequeños en el ADN endógeno, muchas mutaciones creadas a través de la edición del genoma podrían ocurrir en teoría a través de la mutagénesis natural o, en el contexto de las plantas, a través del [[mejoramiento por mutación]] que es parte de la reproducción convencional (en contraste, la inserción de un transgén en crear un [[Organismo genéticamente modificado|Organismo Genéticamente Modificado (OGM)]] no podría ocurrir naturalmente). Sin embargo, hay excepciones a esta regla general; como se explica en la introducción, GT puede introducir una variedad de tamaños posibles de ediciones en el ADN; desde ediciones muy pequeñas, como cambiar, insertar o eliminar 1 par de bases, hasta insertar secuencias de ADN mucho más largas, que en teoría podrían incluir la inserción de un transgén completo. Sin embargo, en la práctica, GT se usa más comúnmente para insertar secuencias más pequeñas. La gama de ediciones posibles a través de GT puede dificultar la regulación (ver Regulación).

Las dos formas más establecidas de edición de genes son la '''gene targeting''' y la '''mutagénesis dirigida'''. Mientras que la selección de genes se basa en la vía de reparación del ADN de [[Reparación dirigida por homología|reparación dirigida por homología (HDR)]] (también llamada [[recombinación homóloga]], HR), la mutagénesis dirigida utiliza la [[unión de extremos no homólogos]] (NHEJ, por sus siglas en inglés) de ADN roto. NHEJ es una vía de reparación de ADN propensa a errores, lo que significa que cuando repara el ADN roto puede insertar o eliminar bases de ADN, creando inserciones o eliminaciones (indels). El usuario no puede especificar cuáles serán estas indeles aleatorias, por lo tanto, no puede controlar exactamente qué ediciones se realizan en el sitio de destino. Sin embargo, pueden controlar dónde ocurrirán estas ediciones (es decir, dictar el sitio de destino) mediante el uso de una nucleasa específica del sitio (anteriormente nucleasas de dedo de zinc y [[TALEN]], ahora comúnmente CRISPR) para romper el ADN en el sitio de destino. En la siguiente figura se muestra un resumen de la selección de genes a través de HDR (también llamada recombinación homóloga) y la mutagénesis dirigida a través de NHEJ.

Las técnicas de edición de genes desarrolladas más recientemente de edición de calidad y edición básica,<ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/s41587-020-0561-9|título=Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors|apellidos=Anzalone|nombre=Andrew V.|apellidos2=Koblan|nombre2=Luke W.|fecha=2020-07-01|publicación=Nature Biotechnology|volumen=38|número=7|páginas=824–844|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=1087-0156|doi=10.1038/s41587-020-0561-9|apellidos3=Liu|nombre3=David R.}}</ref> basadas en métodos CRISPR-Cas, son alternativas a la selección de genes, que también pueden crear ediciones definidas por el usuario en ubicaciones genómicas específicas. Sin embargo, cada uno está limitado en la longitud de inserción posible de la secuencia de ADN; la edición básica se limita a conversiones<ref>{{Cita web|url=https://blog.addgene.org/single-base-editing-with-crispr|título=CRISPR 101: Cytosine and Adenine Base Editors|fechaacceso=2023-07-15|apellido=Gearing|nombre=Mary|sitioweb=blog.addgene.org|idioma=en-us}}</ref> de un solo par de bases, mientras que la edición principal solo puede insertar secuencias de hasta ~44 pb.<ref>{{Cita web|url=https://blog.addgene.org/prime-editing-crisp-cas-reverse-transcriptase|título=Prime Editing: Adding Precision and Flexibility to CRISPR Editing|fechaacceso=2023-07-15|apellido=Tsang|nombre=Jennifer|sitioweb=blog.addgene.org|idioma=en-us}}</ref><ref>{{Cita publicación|url=https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4|título=Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA|apellidos=Anzalone|nombre=Andrew V.|apellidos2=Randolph|nombre2=Peyton B.|fecha=2019-12-05|publicación=Nature|volumen=576|número=7785|páginas=149–157|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=0028-0836|doi=10.1038/s41586-019-1711-4|pmc=PMC6907074|pmid=31634902|apellidos3=Davis|nombre3=Jessie R.|apellidos4=Sousa|nombre4=Alexander A.|apellidos5=Koblan|nombre5=Luke W.|apellidos6=Levy|nombre6=Jonathan M.|apellidos7=Chen|nombre7=Peter J.|apellidos8=Wilson|nombre8=Christopher|apellidos9=Newby|nombre9=Gregory A.}}</ref> Por lo tanto, GT sigue siendo el método principal de inserción dirigida (específica de la ubicación) de secuencias largas de ADN para la ingeniería genómica.

== Comparación con la captura de genes ==
La captura de genes se basa en la inserción aleatoria de un cassette, mientras que la selección de genes manipula un gen específico. Los cassettes se pueden usar para muchas cosas diferentes, mientras que las regiones de homología flanqueantes de los cassettes dirigidos a genes deben adaptarse para cada gen. Esto hace que la captura de genes sea más fácil de manejar para proyectos a gran escala que la focalización. Por otro lado, la selección de genes puede usarse para genes con transcripciones bajas que pasarían desapercibidos en una pantalla trampa. La probabilidad de captura aumenta con el tamaño del [[intrón]], mientras que para la selección de genes, los genes pequeños se alteran con la misma facilidad.

== Aplicaciones ==
El ''gene targeting'' se ha utilizado ampliamente para estudiar enfermedades genéticas humanas mediante la eliminación ("[[bloqueo de genes]]") o la adición ("inclusión") de mutaciones específicas de interés.<ref>{{Cita web|url=https://www.xenograft.net/applications/|título=Applications of Xenografting {{!}} Xenograft Services|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en-US}}</ref> Anteriormente utilizados para diseñar modelos de células de rata, los avances en tecnologías de selección de genes permiten una nueva ola de modelos de enfermedades humanas isogénicas. Estos modelos son los modelos [[in vitro]] más precisos disponibles para los investigadores y facilitan el desarrollo de fármacos y diagnósticos personalizados, especialmente en [[oncología]].<ref>{{Cita publicación|url=https://pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.0813333106|título=A panel of isogenic human cancer cells suggests a therapeutic approach for cancers with inactivated p53|apellidos=Sur|nombre=Surojit|apellidos2=Pagliarini|nombre2=Raymond|fecha=2009-03-10|publicación=Proceedings of the National Academy of Sciences|volumen=106|número=10|páginas=3964–3969|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=0027-8424|doi=10.1073/pnas.0813333106|pmc=PMC2656188|pmid=19225112|apellidos3=Bunz|nombre3=Fred|apellidos4=Rago|nombre4=Carlo|apellidos5=Diaz|nombre5=Luis A.|apellidos6=Kinzler|nombre6=Kenneth W.|apellidos7=Vogelstein|nombre7=Bert|apellidos8=Papadopoulos|nombre8=Nickolas}}</ref>

== Regulación de organismos dirigidos por genes ==
Como se explicó anteriormente, ''gene targeting'' es técnicamente capaz de crear una variedad de tamaños de cambios genéticos; desde mutaciones de un solo par de bases hasta la inserción de secuencias más largas, incluidos potencialmente transgenes. Esto significa que los productos de la selección de genes pueden ser indistinguibles de la mutación natural, o pueden ser equivalentes a los OMG debido a la inserción de un transgén (consulte el diagrama de Venn anterior). Por lo tanto, regular los productos de ''gene targeting'' puede ser un desafío y diferentes países han adoptado diferentes enfoques o están revisando cómo hacerlo como parte de revisiones regulatorias más amplias de los productos de edición de genes.<ref>{{Cita web|url=https://crispr-gene-editing-regs-tracker.geneticliteracyproject.org/|título=Global Gene Editing Regulation Tracker|fechaacceso=2023-07-15|sitioweb=Global Gene Editing Regulation Tracker|idioma=en-US}}</ref><ref>{{Cita libro|título=Regulatory Constraints and Differences of Genome-Edited Crops Around the Globe|url=https://link.springer.com/10.1007/978-3-031-08072-2_17|editorial=Springer International Publishing|fecha=2022|fechaacceso=2023-07-15|isbn=978-3-031-08071-5|páginas=319–341|doi=10.1007/978-3-031-08072-2_17|idioma=en|nombre=Penny|apellidos=Hundleby|nombre2=Wendy|apellidos2=Harwood|nombre-editor=Shabir Hussain|apellido-editor=Wani}}</ref><ref>{{Cita publicación|url=https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S2452072119300371|título=An overview of regulatory approaches to genome editing in agriculture|apellidos=Friedrichs|nombre=Steffi|apellidos2=Takasu|nombre2=Yoko|fecha=2019-07|publicación=Biotechnology Research and Innovation|volumen=3|número=2|páginas=208–220|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|doi=10.1016/j.biori.2019.07.001|apellidos3=Kearns|nombre3=Peter|apellidos4=Dagallier|nombre4=Bertrand|apellidos5=Oshima|nombre5=Ryudai|apellidos6=Schofield|nombre6=Janet|apellidos7=Moreddu|nombre7=Catherine}}</ref> Las clasificaciones ampliamente adoptadas dividen los organismos editados genéticamente en tres clases de "SDN1-3", en referencia a las nucleasas dirigidas al sitio (como CRISPR-Cas) que se utilizan para generar organismos editados genéticamente.<ref>{{Cita web|url=https://www.fao.org/documents/card/en?details=cc5136en|título=Publication preview page {{!}} FAO {{!}} Food and Agriculture Organization of the United Nations|fechaacceso=2023-07-15|sitioweb=FAODocuments|idioma=en}}</ref><ref>{{Cita libro|título=Gene editing and agrifood systems|url=http://www.fao.org/documents/card/en/c/cc3579en|editorial=FAO|fecha=2022-12-19|fechaacceso=2023-07-15|isbn=978-92-5-137417-7|doi=10.4060/cc3579en|idioma=en}}</ref> Estas clasificaciones de SDN pueden guiar las regulaciones nacionales en cuanto a qué clase de SDN considerarán como "OGM" y, por lo tanto, cuáles están sujetas a regulaciones potencialmente estrictas.

* SDN1 = organismos creados mediante unión final no homóloga de una ruptura catalizada por SDN en el ADN. Por lo tanto, se han producido mutaciones aleatorias a través del NHEJ propenso a errores, y no se ha utilizado una plantilla de reparación (por lo tanto, no es ''gene targeting''). A menudo sujeto a una supervisión regulatoria menos estricta debido a la falta de uso de una plantilla de reparación de ADN y de equivalencia con las técnicas de mejoramiento convencionales (en el caso del mejoramiento de plantas).
* SDN2 = se han introducido una o varias mutaciones específicas en el gen objetivo en el sitio de corte de SDN mediante el uso de una plantilla de reparación de homología (por lo tanto, esto es ''gene targeting'').
* SDN3 = se han insertado secuencias más largas en el sitio de corte, mediante recombinación homóloga (es decir, orientación genética) o a través de NHEJ.<ref>{{Cita libro|título=Gene editing and agrifood systems|url=http://www.fao.org/documents/card/en/c/cc3579en|editorial=FAO|fecha=2022-12-19|fechaacceso=2023-07-15|isbn=978-92-5-137417-7|doi=10.4060/cc3579en|idioma=en}}</ref> Las "secuencias más largas" normalmente se refieren a elementos genéticos completos, como promotores o regiones codificantes de proteínas. Estos a menudo se consideran transgénicos y, por lo tanto, a menudo se clasifican como OMG.<ref>{{Cita publicación|url=https://www.embopress.org/doi/10.15252/embr.202050680|título=The evolving landscape around genome editing in agriculture: Many countries have exempted or move to exempt forms of genome editing from GMO regulation of crop plants|apellidos=Schmidt|nombre=Sarah M|apellidos2=Belisle|nombre2=Melinda|fecha=2020-06-04|publicación=EMBO reports|volumen=21|número=6|fechaacceso=2023-07-15|idioma=en|issn=1469-221X|doi=10.15252/embr.202050680|pmc=PMC7271327|pmid=32431018|apellidos3=Frommer|nombre3=Wolf B}}</ref>

Históricamente, la [[Unión Europea]] (UE) se ha opuesto ampliamente a la tecnología de modificación genética, por motivos de su [[principio de precaución]]. En 2018, el [[Tribunal de Justicia de las Comunidades Europeas]] (TJCE) dictaminó que los cultivos modificados genéticamente (incluidos los cultivos dirigidos genéticamente) deben considerarse modificados genéticamente<ref>{{Cita noticia|título=Gene-edited plants and animals are GM foods, EU court rules|url=https://www.theguardian.com/environment/2018/jul/25/gene-editing-is-gm-europes-highest-court-rules|periódico=The Guardian|fecha=2018-07-25|fechaacceso=2023-07-15|issn=0261-3077|idioma=en-GB|nombre=Arthur|apellidos=Neslen}}</ref> y, por lo tanto, están sujetos a la Directiva OMG, que impone importantes cargas reglamentarias sobre el uso de OMG. Sin embargo, esta decisión fue recibida negativamente por la comunidad científica europea.<ref>{{Cita web|url=https://www.eu-sage.eu/index.php/about|título=Publications {{!}} EU-SAGE|fechaacceso=2023-07-15|sitioweb=www.eu-sage.eu}}</ref> En 2021, la [[Comisión Europea]] consideró que la legislación actual de la UE que rige las técnicas de modificación genética y edición de genes (o NGT, nuevas técnicas genómicas) "no era adecuada para su propósito" y necesitaba adaptarse para reflejar el progreso científico y tecnológico.<ref>{{Cita web|url=https://food.ec.europa.eu/plants/genetically-modified-organisms/new-techniques-biotechnology/ec-study-new-genomic-techniques_en|título=EC study on new genomic techniques|fechaacceso=2023-07-15|sitioweb=food.ec.europa.eu|idioma=en}}</ref> En julio de 2023, la Comisión Europea publicó una propuesta para cambiar las reglas de ciertos productos de edición de genes para reducir los requisitos reglamentarios para los organismos desarrollados con edición de genes que contenían cambios genéticos que podrían haber ocurrido de forma natural.<ref>{{Obra citada|título=Proposal for a REGULATION OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL on plants obtained by certain new genomic techniques and their food and feed, and amending Regulation (EU) 2017/625|idioma=en|url=https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX:52023PC0411|fechaacceso=2023-07-15|fecha=2023}}</ref>


== Véase también ==
== Véase también ==
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* [[ingeniería genética]]
* [[ingeniería genética]]
* [[Ratón knockout]]
* [[Ratón knockout]]
* [[Recombinación genética]]
* [[Intercambio de Cassette Recombinasa Mediada]]
* [[Receptor de tipo Toll]]


== Referencias ==
== Referencias ==

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Dos ratones knockout

Se define gene targeting (del inglés, 'apuntar a un gen') como una técnica que se sirve de la recombinación homóloga para modificar un gen. Esta metodología, puesta a punto por el biólogo ítalo-estadounidense Mario Capecchi (premio Nobel de medicina en 2007, junto a sus colegas Martin Evans y Oliver Smithies[1]​), permite cancelar el gen e introducir mutaciones.

La selección de genes puede ser permanente o condicional. Las condiciones pueden ser un momento específico durante el desarrollo / la vida del organismo o la limitación a un tejido específico, por ejemplo. El gene targeting requiere la creación de un vector específico para cada gen de interés. Se trata en todo caso de una metodología muy versátil, puesto que puede utilizarse para casi cualquier tipo de gen, independientemente de la expresión del gen.

El gene targeting permite estudiar un gen, analizando en vivo cualquier evento biológico que se desarrolla en caso de ausencia o mutación del gen mismo. La aplicación de esta técnica ha tenido y continua teniendo un gran éxito en diversos campos de la investigación biomédica.

Métodos

El método para la realización de un gene targeting varían según el organismo utilizado. El gene targeting sobre el Mus musculus (el ratón común), por ejemplo, sigue generalmente el siguiente pasaje:

  1. realización a partir de bacterias de una construcción de ADN intermediario que contiene típicamente parte del gen objetivo, un gen de reporte y un marcador de selección;
  2. inserción de esta construcción en el interior de células estaminales embrionarias del ratón en cultivo;
  3. selección de las células que presentan una inserción correcta, y su inyección en el interior de los tejidos de un embrión de ratón;
  4. nacimiento del ratón quimera, con contenido genético modificado, y selección de los animales genéticamente modificados.

En general, el ADN que contiene parte de un gen hacer modificado, un gen reportero y un marcador seleccionable (dominante) se ensamblan en bacterias.

Para "apuntar" a los genes en el musgo, el ADN se incuba junto con protoplastos recién aislados y con polietilenglicol. Dado que los musgos son organismos haploides,[2]​ los filamentos de musgo (protonema) pueden examinarse directamente para detectar el objetivo, ya sea mediante el tratamiento con antibióticos o con PCR. Único entre las plantas, este procedimiento de genética inversa es tan eficiente como en la levadura.[3]​ La selección de genes se ha aplicado con éxito en bovinos, ovinos, porcinos y varios hongos.

La frecuencia de selección de genes puede mejorarse significativamente mediante el uso de endonucleasas diseñadas,[4]​ como las nucleasas con dedos de zinc,[5]​ endonucleasas dirigidas diseñadas, y nucleasas basadas en efectores TAL diseñados.[6]​ Este método se ha aplicado a especies como Drosophila melanogaster,[4]​ tabaco,[7]​[8]​ maíz,[9]​ células humanas,[10]​ ratones[11]​ y ratas.[12]​

Comparación con otras formas de ingeniería genética

La relación entre la selección de genes, la edición de genes y la modificación genética se describe en el siguiente diagrama de Venn. Se muestra cómo la "ingeniería genética" abarca las tres de estas técnicas. La edición del genoma se caracteriza por realizar pequeñas ediciones en el genoma en una ubicación específica, a menudo después del corte de la región de ADN objetivo por una nucleasa específica del sitio como CRISPR. La modificación genética generalmente describe la inserción de un transgén (ADN extraño, es decir, un gen de otra especie) en una ubicación aleatoria dentro del genoma. La orientación genética es una herramienta biotecnológica específica que puede conducir a pequeños cambios en el genoma en un sitio específico, en cuyo caso las ediciones causadas por la orientación genética contarían como edición del genoma. Sin embargo, la selección de genes también es capaz de insertar genes completos (como transgenes) en el sitio de destino si el transgén se incorpora a la plantilla de reparación de homología que se usa durante la selección de genes. En tales casos, las ediciones causadas por la orientación genética se considerarían, en algunas jurisdicciones, como equivalentes a la modificación genética ya que se ha producido la inserción de ADN extraño.

La selección de genes es una forma específica de herramienta de edición del genoma. Otras herramientas de edición del genoma incluyen la mutagénesis dirigida, la edición básica y la edición de calidad, todas las cuales crean ediciones en el ADN endógeno (ADN ya presente en el organismo) en una ubicación genómica específica.[13]​[14]​ Esta naturaleza específica de sitio o "dirigida" de la edición del genoma es típicamente lo que hace que la edición del genoma sea diferente a la "modificación genética" tradicional que inserta un transgén en una ubicación no específica en el genoma de los organismos, así como la edición de genes haciendo pequeñas ediciones del ADN ya presente en los organismos, frente a la inserción de modificación genética de ADN "extraño" de otra especie.[15]​[16]​

Debido a que la edición de genes produce cambios más pequeños en el ADN endógeno, muchas mutaciones creadas a través de la edición del genoma podrían ocurrir en teoría a través de la mutagénesis natural o, en el contexto de las plantas, a través del mejoramiento por mutación que es parte de la reproducción convencional (en contraste, la inserción de un transgén en crear un Organismo Genéticamente Modificado (OGM) no podría ocurrir naturalmente). Sin embargo, hay excepciones a esta regla general; como se explica en la introducción, GT puede introducir una variedad de tamaños posibles de ediciones en el ADN; desde ediciones muy pequeñas, como cambiar, insertar o eliminar 1 par de bases, hasta insertar secuencias de ADN mucho más largas, que en teoría podrían incluir la inserción de un transgén completo. Sin embargo, en la práctica, GT se usa más comúnmente para insertar secuencias más pequeñas. La gama de ediciones posibles a través de GT puede dificultar la regulación (ver Regulación).

Las dos formas más establecidas de edición de genes son la gene targeting y la mutagénesis dirigida. Mientras que la selección de genes se basa en la vía de reparación del ADN de reparación dirigida por homología (HDR) (también llamada recombinación homóloga, HR), la mutagénesis dirigida utiliza la unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés) de ADN roto. NHEJ es una vía de reparación de ADN propensa a errores, lo que significa que cuando repara el ADN roto puede insertar o eliminar bases de ADN, creando inserciones o eliminaciones (indels). El usuario no puede especificar cuáles serán estas indeles aleatorias, por lo tanto, no puede controlar exactamente qué ediciones se realizan en el sitio de destino. Sin embargo, pueden controlar dónde ocurrirán estas ediciones (es decir, dictar el sitio de destino) mediante el uso de una nucleasa específica del sitio (anteriormente nucleasas de dedo de zinc y TALEN, ahora comúnmente CRISPR) para romper el ADN en el sitio de destino. En la siguiente figura se muestra un resumen de la selección de genes a través de HDR (también llamada recombinación homóloga) y la mutagénesis dirigida a través de NHEJ.

Las técnicas de edición de genes desarrolladas más recientemente de edición de calidad y edición básica,[17]​ basadas en métodos CRISPR-Cas, son alternativas a la selección de genes, que también pueden crear ediciones definidas por el usuario en ubicaciones genómicas específicas. Sin embargo, cada uno está limitado en la longitud de inserción posible de la secuencia de ADN; la edición básica se limita a conversiones[18]​ de un solo par de bases, mientras que la edición principal solo puede insertar secuencias de hasta ~44 pb.[19]​[20]​ Por lo tanto, GT sigue siendo el método principal de inserción dirigida (específica de la ubicación) de secuencias largas de ADN para la ingeniería genómica.

Comparación con la captura de genes

La captura de genes se basa en la inserción aleatoria de un cassette, mientras que la selección de genes manipula un gen específico. Los cassettes se pueden usar para muchas cosas diferentes, mientras que las regiones de homología flanqueantes de los cassettes dirigidos a genes deben adaptarse para cada gen. Esto hace que la captura de genes sea más fácil de manejar para proyectos a gran escala que la focalización. Por otro lado, la selección de genes puede usarse para genes con transcripciones bajas que pasarían desapercibidos en una pantalla trampa. La probabilidad de captura aumenta con el tamaño del intrón, mientras que para la selección de genes, los genes pequeños se alteran con la misma facilidad.

Aplicaciones

El gene targeting se ha utilizado ampliamente para estudiar enfermedades genéticas humanas mediante la eliminación ("bloqueo de genes") o la adición ("inclusión") de mutaciones específicas de interés.[21]​ Anteriormente utilizados para diseñar modelos de células de rata, los avances en tecnologías de selección de genes permiten una nueva ola de modelos de enfermedades humanas isogénicas. Estos modelos son los modelos in vitro más precisos disponibles para los investigadores y facilitan el desarrollo de fármacos y diagnósticos personalizados, especialmente en oncología.[22]​

Regulación de organismos dirigidos por genes

Como se explicó anteriormente, gene targeting es técnicamente capaz de crear una variedad de tamaños de cambios genéticos; desde mutaciones de un solo par de bases hasta la inserción de secuencias más largas, incluidos potencialmente transgenes. Esto significa que los productos de la selección de genes pueden ser indistinguibles de la mutación natural, o pueden ser equivalentes a los OMG debido a la inserción de un transgén (consulte el diagrama de Venn anterior). Por lo tanto, regular los productos de gene targeting puede ser un desafío y diferentes países han adoptado diferentes enfoques o están revisando cómo hacerlo como parte de revisiones regulatorias más amplias de los productos de edición de genes.[23]​[24]​[25]​ Las clasificaciones ampliamente adoptadas dividen los organismos editados genéticamente en tres clases de "SDN1-3", en referencia a las nucleasas dirigidas al sitio (como CRISPR-Cas) que se utilizan para generar organismos editados genéticamente.[26]​[27]​ Estas clasificaciones de SDN pueden guiar las regulaciones nacionales en cuanto a qué clase de SDN considerarán como "OGM" y, por lo tanto, cuáles están sujetas a regulaciones potencialmente estrictas.

  • SDN1 = organismos creados mediante unión final no homóloga de una ruptura catalizada por SDN en el ADN. Por lo tanto, se han producido mutaciones aleatorias a través del NHEJ propenso a errores, y no se ha utilizado una plantilla de reparación (por lo tanto, no es gene targeting). A menudo sujeto a una supervisión regulatoria menos estricta debido a la falta de uso de una plantilla de reparación de ADN y de equivalencia con las técnicas de mejoramiento convencionales (en el caso del mejoramiento de plantas).
  • SDN2 = se han introducido una o varias mutaciones específicas en el gen objetivo en el sitio de corte de SDN mediante el uso de una plantilla de reparación de homología (por lo tanto, esto es gene targeting).
  • SDN3 = se han insertado secuencias más largas en el sitio de corte, mediante recombinación homóloga (es decir, orientación genética) o a través de NHEJ.[28]​ Las "secuencias más largas" normalmente se refieren a elementos genéticos completos, como promotores o regiones codificantes de proteínas. Estos a menudo se consideran transgénicos y, por lo tanto, a menudo se clasifican como OMG.[29]​

Históricamente, la Unión Europea (UE) se ha opuesto ampliamente a la tecnología de modificación genética, por motivos de su principio de precaución. En 2018, el Tribunal de Justicia de las Comunidades Europeas (TJCE) dictaminó que los cultivos modificados genéticamente (incluidos los cultivos dirigidos genéticamente) deben considerarse modificados genéticamente[30]​ y, por lo tanto, están sujetos a la Directiva OMG, que impone importantes cargas reglamentarias sobre el uso de OMG. Sin embargo, esta decisión fue recibida negativamente por la comunidad científica europea.[31]​ En 2021, la Comisión Europea consideró que la legislación actual de la UE que rige las técnicas de modificación genética y edición de genes (o NGT, nuevas técnicas genómicas) "no era adecuada para su propósito" y necesitaba adaptarse para reflejar el progreso científico y tecnológico.[32]​ En julio de 2023, la Comisión Europea publicó una propuesta para cambiar las reglas de ciertos productos de edición de genes para reducir los requisitos reglamentarios para los organismos desarrollados con edición de genes que contenían cambios genéticos que podrían haber ocurrido de forma natural.[33]​

Véase también

Referencias

  1. ↑ «Press Release: The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine». Consultado el 8 de octubre de 2007. 
  2. ↑ Reski, R. (1998-02). «Development, Genetics and Molecular Biology of Mosses». Botanica Acta (en inglés) 111 (1): 1-15. doi:10.1111/j.1438-8677.1998.tb00670.x. Consultado el 15 de julio de 2023. 
  3. ↑ Reski, Ralf (1998-06). «Physcomitrella and Arabidopsis: the David and Goliath of reverse genetics». Trends in Plant Science 3 (6): 209-210. ISSN 1360-1385. doi:10.1016/s1360-1385(98)01257-6. Consultado el 15 de julio de 2023. 
  4. ↑ a b Grizot, Sylvestre; Smith, Julianne; Daboussi, Fayza; Prieto, Jesús; Redondo, Pilar; Merino, Nekane; Villate, Maider; Thomas, Séverine et al. (2009-09). «Efficient targeting of a SCID gene by an engineered single-chain homing endonuclease». Nucleic Acids Research (en inglés) 37 (16): 5405-5419. ISSN 1362-4962. PMC 2760784. PMID 19584299. doi:10.1093/nar/gkp548. Consultado el 15 de julio de 2023. 
  5. ↑ Bibikova, Marina; Beumer, Kelly; Trautman, Jonathan K.; Carroll, Dana (2 de mayo de 2003). «Enhancing Gene Targeting with Designed Zinc Finger Nucleases». Science (en inglés) 300 (5620): 764-764. ISSN 0036-8075. doi:10.1126/science.1079512. Consultado el 15 de julio de 2023. 
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  9. ↑ Shukla, Vipula K.; Doyon, Yannick; Miller, Jeffrey C.; DeKelver, Russell C.; Moehle, Erica A.; Worden, Sarah E.; Mitchell, Jon C.; Arnold, Nicole L. et al. (2009-05). «Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases». Nature (en inglés) 459 (7245): 437-441. ISSN 0028-0836. doi:10.1038/nature07992. Consultado el 15 de julio de 2023. 
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  12. ↑ Cui, Xiaoxia; Ji, Diana; Fisher, Daniel A; Wu, Yumei; Briner, David M; Weinstein, Edward J (2011-01). «Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases». Nature Biotechnology (en inglés) 29 (1): 64-67. ISSN 1087-0156. doi:10.1038/nbt.1731. Consultado el 15 de julio de 2023. 
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