Usuario:Wiki210397/Taller/Sitio Múltiple de Clonación

Un vector de clonación pUC19 que muestra la secuencia del sitio múltiple de clonación con sitios de enzimas de restricción.

Un sitio múltiple de clonación (SMC), también llamado polylinker, es un segmento corto de ADN que contiene muchos (hasta ~20) sitios de restricción - una característica estándar de los plásmidos diseñados.​ Los sitios de restricción dentro de un SMC son generalmente únicos, ocurriendo solo una vez dentro de un plásmido dado. El propósito de un SMC en un plásmido es permitir la inserción de un fragmento de ADN en esa región.​ Un SMC se encuentra en una variedad de vectores, incluidos los vectores de clonación para aumentar el número de copias del ADN objetivo, y en vectores de expresión para crear un producto proteico.​

Cómo hacer un SMC

En algunos casos, un vector no puede contener un SMC, en este caso, se puede agregar un SMC a un vector; este método también se puede usar para agregar nuevos sitios de restricción a un sitio múltiple de clonación .​ El primer paso es diseñar secuencias de oligonucleótidos complementarias que contienen sitios de enzimas de restricción junto con bases adicionales en el extremo, las cuales son complementarias al vector después de su digestión. Entonces, las secuencias de oligonucleótidos se pueden hibridar y ligar en el vector digerido y purificado. El vector digerido se corta con una enzima de restricción que complementa los salientes del inserto de oligonucleótidos. Después de la ligadura, se transforma el vector en bacterias y se verifica el injerto mediante secuenciación.

Un diagrama que muestra el proceso de inserción de un sitio de clonación múltiple en un vector plasmídico.

Usos

Los sitios múltiples de clonación son una característica que permite la inserción de ADN extraño sin alterar el resto del plásmido, lo que lo hace extremadamente útil en biotecnología, bioingeniería y genética molecular.​ Un SMC puede ayudar a hacer organismos transgénicos, más comúnmente conocidos como organismos genéticamente modificados (OGM) mediante la ingeniería genética. Para aprovechar el SMC en ingeniería genética, se debe agregar un gen de interés al vector durante la producción cuando se abre el SMC.​ Después de que se hace y se liga el SMC, se incluirá el gen de interés y se puede amplificar para aumentar el número de copias génicas en un huésped bacteriano. Después de que la bacteria se replica, el gen de interés puede extraerse de la bacteria. En algunos casos, se puede usar un vector de expresión para crear un producto proteico. Después de aislar los productos, éstos tienen una amplia variedad de usos, como la producción de insulina, la creación de vacunas, la producción de antibióticos y la creación de terapias génicas.

Ejemplos

Un plásmido bacteriano utilizado en ingeniería genética como un vector de clonación de plásmido es pUC18. Su región polylinker está compuesta por varios sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, que se han diseñado en un solo grupo.Tiene sitios de restricción para diversas enzimas, que incluyen EcoRI, BamHI y PstI. Otro vector utilizado en ingeniería genética es pUC19, que es similar a pUC18, pero su región polylinker está invertida. E.coli también se usa comúnmente como huesped bacteriano debido a la disponibilidad, velocidad de crecimiento rápida y su versatilidad.​

Con el fin de modificar genéticamente la insulina, el primer paso es cortar el SMC en el plásmido que se utiliza​. Una vez que se ha cortado el SMC, se puede agregar el gen de la insulina humana haciendo que el plásmido se modifique genéticamente. Después de eso, el plásmido genéticamente modificado se coloca en el huésped bacteriano y se deja replicar. Para hacer el gran suministro que se exige, las células huesped se colocan en un gran tanque de fermentación, el que es un ambiente óptimo para el huésped. El proceso finaliza filtrando la insulina del huésped. La purificación puede realizarse para que la insulina se pueda empaquetar y distribuir a personas con diabetes.