El Campeonato de Fútbol del Guayas de 1965, más conocido como la Copa de Guayaquil 1965, fue la 15.ª edición de los campeonatos semiprofesionales del Guayas, dicho torneo fue por la Asoguayas, además este torneo sirvió como clasificatorio para el Campeonato Ecuatoriano de Fútbol 1965, tras no haber participado en el Campeonato Ecuatoriano de Fútbol 1964, esto fue porque los clubes guayaquileño decidieron no participar para darle prioridad al torneo local. Como anécdota esta fue la segunda ocasión de que el Barcelona consiguiera el campeonato de manera invicta y este fue el séptimo torneo en el cual no hubo descenso anteriormente no hubo descenso en los años de 1951, 1952, 1958, 1959, 1963, 1964.
El Barcelona se coronó como campeón por cuarta vez campeón, mientras que el Emelec obtendría su quinto subcampeonato.
El campeonato de Guayaquil se jugó con el formato de dos etapas:
Primera etapa (Etapa única)
Se jugó a una sola etapa en partidos de ida y vuelta; el equipo que consiguió la mayor cantidad de puntos fue el campeón de la edición de 1965 y participó en el Campeonato Ecuatoriano de Fútbol 1965. Asimismo, el subcampeón, y los puestos tercero y cuarto aseguraron su participación.