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La Citogenética es el campo de la Genética que comprende el estudio de la estructura, función y comportamiento de los cromosomas. Incluye análisis de Bandeado G en cromosomas, otras técnicas de bandeado citogenético, y también la citogenética molecular del tipo de hibridación por fluorescencia in situ (FISH) e hibridación por genómica comparativa (CGH).

Célula metafásica positiva para el reordenamiento bcr/abl usando la técnica FISH.

Historia

Primeros años

Los cromosomas fueron observados por primera vez en células vegetales por Karl Wilhelm von Nägeli en 1842. Su comportamiento en células animales (de salamandra) lo describió Walther Flemming, el descubridor de la mitosis, en 1882. Otro anatomista alemán, von Waldeyer, le dio nombre en 1888.

La siguiente etapa tuvo lugar tras el desarrollo de la genética a principios del siglo 20, cuando se dedujo que el conjunto de cromosomas (el cariotipo) era quien portaba los genes. Levitsky parece que fue el primero que definió el cariotipo como la apariencia fenotípica de los cromosomas somáticos, en contraste con su contenido genético.[2][3] La investigación del cariotipo humano llevó muchos años para responder a la pregunta más básica: ¿cuántos cromosomas tiene una célula diploide humana normal? [4] En 1912, Hans von Winiwarter recopiló 47 cromosomas en espermatogonias y 48 en oogonias, concluyendo con un mecanismo de determinación sexual XX/XO.[5] Painter en 1922 no estaba seguro de que el número diploide del hombre fuera 46 o 48, a favor de 46.[6] Cambió su opinión más tarde de 46 a 48, e insistió de manera acertada en que el hombre tenía un sistema XX/XY.[7] Considerando sus técnicas, estos resultados fueron bastante destacables.

Se necesitaban nuevas técnicas para resolver definitivamente el problema:

Utilizando células en cultivo

Pretratando células en un medio hipotónico, el cual penetra y dispersa los cromosomas

Detener la mitosis en metafase con una solución de colchicina

Aplastando la preparación para forzar a los cromosomas a ponerse en un mismo plano

Troceando una fotomicrografía y organizando el resultado en un cariograma indiscutible.

Hasta mediados de los años 50 no fue generalmente aceptado que el cariotipo del hombre incluía sólo 46 cromosomas.[8][9] Y algo muy importante, los grandes primates tenían 48 cromosomas.

Aplicaciones en Biología

Los trabajos de McClintock con el maíz

Barbara McClintock empezó su carrera como citogenetista del maíz. En 1931 McClintock y Harriet Creighton demostraron que la recombinación citológica de cromosomas marcados tenía correlación con la recombinación de rasgos genéticos. McClintock continuó su carrera con el estudio citogenético de los mecanismos y la herencia de cromosomas circulares y fragmentados del maíz. Durante sus trabajos en citogenética, McClintock descubrió los transposones, lo que le condujo a conseguir su Premio Nobel en 1983.[16]

Poblaciones naturales de Drosophila

En los años 30 del siglo XX Dobzhansky y sus colaboradores tomaron Drosophila pseudoobscura y D. persimilis de poblaciones salvajes en California y estados vecinos. Usando la técnica de Painter[10] estudiaron los cromosomas politénicos y descubrieron que las poblaciones salvajes eran polimórficas por las inversiones cromosómicas. Todas las moscas se parecían a cualquiera de las inversiones que portaban: este es un ejemplo de polimorfismo críptico.

Rápidamente se acumularon pruebas para demostrar que la selección natural era responsable. Usando un método ideado por L'Heretier y Teissier, Dobzhansky crió poblaciones en jaulas de cría, que permitía alimentarlas, la reproducción y la toma de muestras de las mismas al mismo tiempo que evitaba que se escaparan. Esto tenía la ventaja de descartar la migración como respuesta a los resultados. Las poblaciones que contienen inversiones de frecuencia inicial conocida se pueden mantener en condiciones controladas. Se encontró que los diferentes tipos de cromosomas no fluctuaban al azar, como sería de ser idealmente neutros, pero se ajustaban a algunas frecuencias en las que se estabilizaban. Cuando Dobzhansky publicó la tercera edición de su libro en 1951[11] estaba convencido de que la morfología de los cromosomas se mantenía en la población por la ventaja de selección de los heterocigotos, como en la mayoría de los polimorfismos.[12][13]

Anomalías numéricas humanas

Con la aparición de procedimientos que permitían enumerar los cromosomas de forma sencilla, inmediatamente se hicieron descubrimientos en relación a anomalías que derivan de los casos de no disyunción los cuales provocan la aparición de aneuploidías (adiciones o deleciones de cromosomas enteros). En 1959, Lejeune[14] encontró que los pacientes con síndrome de Down tenían una copia extra del cromosoma 21. El síndrome de Down es conocido también como trisomía del 21. En 1960, Nowell[15] descubrió un pequeño cromosoma, denominado el cromosoma Filadelfia, el cual se demostró que era la causa de la Leucemia mieloide crónica. 13 años más tarde Janet Rowley probó que se trataba de una translocación de los cromosomas 9 y 22.

Otras anomalías cromosómicas descubiertas incluyen anomalías en cromosomas sexuales. Un individuo que sólo posea un cromosoma sexual (el X) padece el síndrome de Turner, un cromosoma X de más en un varón, con 47 cromosomas en total, padece el Síndrome de Klinefelter. Muchas más combinaciones pueden aparecer sin ser letales como XXX, XYY, y XXXX. La capacidad de los mamíferos para tolerar aneuploidías en cromosomas sexuales deriva de la capacidad de inactivarlos, que se necesita en hembras normales para compensar el tener dos copias del X. No todos los genes del cromosoma X se inactivan, lo que responde a por qué se observa una diferencia fenotípica en individuos con un cromosoma X de más o de menos.

La trisomía del 13 se relaciona con el Síndrome de Patau y la del 18 con el Síndrome de Edward.

Aparición de las técnicas de bandeo

Al final de los 1960 Caspersson desarrolló técnicas de bandeo que teñían los cromosomas de forma diferencial. Esto permite diferenciar a los cromosomas de otras cosas de tamaño similar así como dilucidar las interrupciones y los cromosomas constituyentes que intervengan en translocaciones cromosómicas. Las deleciones en un cromosoma ahora también podrían ser llamadas más específicamente y entendidas mejor. Los síndromes por deleción como el DiGeorge, el Prader-Willi y otros fueron asociados a deleciones del material cromosómico.

Los diagramas de identificación de cromosomas basados en datos de bandeo, se conocen como mapas citogenéticos. Estos mapas se convirtieron en la base de campos oncológicos o prenatales y en seguida se incluyeron citogenéticos en laboratorios clínicos donde los cariotipos permitían la observación de las alteraciones cromosómicas por parte de los científicos. Las técnicas se extendieron para el cultivo de amniocitos libres obtenidos del líquido amniótico, y se ampliaron a todo tipo de cultivos que permitieran mayor resolución de bandeo.

Comienzos de la citogenética molecular

En la década de 1980 se hicieron avances en citogenética molecular. Mientras los marcajes con radioisótopos se habían hibridado con ADN desde 1969, la inovación estaba ahora en las pruebas de marcajes fluorescentes. Hibridándolos con preparados de cromosomas realizados con las técnicas existentes se pasó a llamar hibridación por fluorescencia in situ (FISH). Este cambio aumentó significativamente el uso de técnicas de marcaje fluorescente como las técnicas habituales de marcaje por ser más seguras y poderse utilizar indefinidamente. Otro avances en micromanipulación y examinación de cromosomas condujo a las técnicas de microdisección de cromosomas a que las aberraciones estructurales de cromosomas podían aislarse, clonarse y ser estudiadas con mucho más detalle.

Usos en medicina

En algunos tipos de cáncer, concretamente en noeplasias hematológicas, los citogenéticos pueden determinar qué translocaciones cromosómicas están presentes en las células malignas, facilitando el diagnóstico y la susceptibilidad al tratamiento (por ejemplo el mesilato de imatinib en casos del cromosoma Filadelfia).

En desórdenes congénitos, como el síndrome de Down, los citogenéticos pueden determinar la naturaleza del defecto cromosómico - una "simple" trisomía, un mosaico, translocación "balanceada", una deleción, o una inserción en uno - o ambos – de los parentales, o en el feto. Gracias a la aparición de procedimientos de recolección que permitían una enumeración de cromosomas más fácil, se hicieron descubrimientos muy rápidamente en el incremento de anomalías por casos de no disyunción que causaban aneusomías (adiciones o deleciones de cromosomas enteros). En 1959 Lejeune[2] descubrió en los pacientes de síndrome de Down la existencia de una copia extra del cromosoma 21. En 1960 Nowell[3] descubrió el denominado cromosoma Filadelfia, causante de la Leucemia mieloide crónica. 13 años después, Janet Rowley probó que se trataba de una translocación de los cromosomas 9 y 22.

También se han encontrado anomalías cromosómicas en cromosomas sexuales, pudiendo aparecer individuos con un solo cromosoma sexual (el X) como es el caso del síndrome Turner, o varones con un cromosoma X de más (Síndrome de Klinefelter). Hay constancia de muchas otras combinaciones no letales como los casos de XXX, XYY, o incluso XXXX. En mamíferos hay una gran tolerancia a este tipo de anomalías dado que también se tiene la capacidad de inactivar total o parcialmente algún cromosoma. Éste es el caso de las hembras en las que se inactiva la copia extra de su cromosoma X para compensar el exceso de genes con respecto a los varones.

La trisomía del 13 se relaciona con el Síndrome de Patau y la trisomía del 18 con el Síndrome de Edward. Además de esto, actualmente esta ciencia se está volcando en el uso de sus técnicas, y especialmente la citogenética molecular, para el pronóstico y el diagnóstico de diversos tipos de cáncer. En cuanto a otras enfermedades podemos destacar las neoplasias y las hematopatías como diana de las técnicas de citogenética más destacadas.

Técnicas

Análisis rutinarios

Los análisis de cromosomas rutinarios hace referencia a los análisis de cromosomas metafásicos que se han teñido usando tripsina seguida de Giemsa, Leishmanns, o una mezcla de ambas. Esto origina patrones de bandas únicos en los cromosomas. El mecanismo molecular y el motivo de estos patrones se desconoce, aunque podría estar relacionado con la replicación y el empaquetamiento.

En los laboratorios citogenéticos se utilizan diversas técnicas de bandeo de cromosomas. El bandeo por Quinacrina (bandeo-Q) fue la primera tinción utilizada para la obtención de patrones de bandas específicos. Este método requiere un microscopio de fluorescencia y ya no es usado tan ampliamente como el bandeo con Giemsa (bandeo-G). El bandeo de inversión (bandeo-R) necesita tratamiento por calor e invierte las bandas blancas y negras habituales de los bandeos G y Q. Este método es muy útil si se quieren teñir los extremos distales de los cromosomas. Otras técnicas de tinción incluyen bandeo-C y tinción de la zona del organizador nucleolar (tinción NOR). Estas últimas técnicas tiñen porciones específicas del cromosoma. El bandeo-C tiñe la heterocromatina estructural, que se encuentra normalmente cerca del centrómero, y la tinción NOR resalta los satélites y los brazos de los cromosomas acrocéntricos. El bandeo a mayor resolución incluye la tinción de cromosomas en profase o metafase temprana (prometafase), antes de alcanzar la máxima condensación. Porque los cromosomas profásicos y prometafásicos están menos condensados que los cromosomas de la metafase, el número de bandas observables para todos los cromosomas aumenta en 300 a 450 y hasta 800. Esto permite detectar anomalías menos obvias que normalmente no se verían con los bandeos convencionales.

Preparación de muestras

Las células de la médula ósea, la sangre, el líquido amniótico, la sangre del condón umbilical, los tumores, y tejidos (incluyendo piel, cordón umbilical, hígado, y muchos otros órganos) se pueden cultivar usando técnicas de cultivo celular estándar con el fin de incrementar su número. Un inhibidor mitótico (colchicina, colcemida) se añade al cultivo para parar la división celular en la mitosis, lo cual nos dará una mayor producción de células mitóticas para los análisis. Después, las células se centrifugan, y el medio y el inhibidor mitótico se eliminan y se sustituyen por una solución hipotónica. Esto provoca que las células se hinchen por lo que los cromosomas se dispersarán cuando se añadan a la muestra. Tras poner a las células en un medio hipotónico, se añade fijador Carnoy (metanol y ácido acético glacial 3:1). Esto matará a las células, lisará los eritrocitos, y endurecerá los núcleos de los glóbulos blancos que queden. Las células se fijan rápido por regla general para eliminar los restos de los eritrocitos sobrantes. La suspensión de células entonces cesa en las muestras de los especímenes. Tras el paso de las muestras por un horno o esperando unos días, están listas para el bandeo y el análisis.

Análisis

El análisis de cromosomas bandeados se hace al microscopio por un laboratorio clínico especializado en citogenética (CLSp(CG)). En general se analizan unas 20 células, que es suficiente para descartar el mosaicismo a un buen nivel. Se hace un sumario de los resultados que son estudiados por un citogenetista y se remiten al médico para poder escribir una interpretación teniendo en cuenta la historia clínica previa de los pacientes y otros datos clínicos. Se informan los resultados según el Sistema Internacional de Nomenclatura de Citogenética Humana 2005 (International System for Human Cytogenetic Nomenclature 2005, ISCN2005).

Hibridación por fluorescencia in situ

Células de interfase positivas para una reordenación de t(9;22).

Hibridación por fluorescencia in situ significa utilizar sondas marcadas por fluorescencia para hibridar preparaciones citogenéticas de células.

Además de en las preparaciones estándar, la FISH también se puede utilizar en:

frotis de médula ósea

frotis de sangre

preparaciones de tejido incluidas en parafina

muestras de tejido disociadas enzimáticamente

médula ósea sin cultivar

amniocitos sin cultivar

preparaciones de células centrifugadas

Preparación de muestras

La muestra se trata con una solución de sal que normalmente consiste en 2X SSC (sal, citrato de sodio). Después las muestras se deshidratan en etanol, y se añade la mezcla de sondas. La muestra de ADN y la sonda de ADN se codesnaturalizan por calor y dejando un plazo de al menos 4 horas para la reasociación. Tras esto, las muestras se lavan para eliminar el exceso de sondas que no se hayan unido, y se contratiñe con 4',6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) o propidio yodado.

Análisis

El análisis de especímenes de FISH se hace con microscopios de fluorescencia y los realizan laboratorios clínicos especializados en citogenética (CLSp(CG)). Para oncología en general se apuntan un gran número de células interfásicas en orden para descartar bajos niveles de enfermedades residuales, normalmente entre 200 y 1000 células se contabilizan y apuntan. Para problemas congénitos, se emplean habitualmente unas 20 células metafásicas.

Otras técnicas

Ya hemos mencionado técnicas de uso habitual en análisis citogenético, pero haciendo un resumen de todas ellas y dividiéndolas en grupos según los campos a los que pertenecen, tenemos:

Análisis citogenético: aquí podemos incluir técnicas como bandeado G, FISH, CGH (hibridación genómica comparada)o el cariotipo multicolor (SKY-FISH y M-FISH). Estas últimas del cariotipo multicolor son muy recientes y consisten en marcar el material genético de cada cromosoma con uno o varios fluorocromos, haciéndolos así diferenciables. El espectro de emisión de cada uno es único y así obtenemos cromosomas de diversos colores.

Análisis molecular: la técnica más destacable en este caso es la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esta técnica se caracteriza por su gran aplicabilidad dado que amplifica secuencias específicas de ADN o ARN, y multiplica por más de 100 el número de copias que se puedan obtener de un fragmento de ADN en concreto, algo muy ventajoso para cualquier estudio que se realice.

Citogenética molecular

Consiste en la combinación de biología molecular y citogenética. Por lo general, esto incluye la utilización de una serie de técnicas del estilo de hibridación por fluorescencia in situ (FISH), en la cual las muestras de ADN están marcadas con diferentes colorantes que emiten fluorescencia para así poder visualizar mejor las regiones específicas del genoma que se quiera. La FISH también puede emplearse para observar directamente los cromosomas metafásicos o los núcleos interfásicos. A parte, se puede tomar un método indirecto en el que el genoma completo es evaluado en cuanto a cambios en el número de copias utilizando un cariotipo virtual. Los cariotipos virtuales se generan a partir de matrices compuestas de miles de millones de muestras, y se usan herramientas computacionales con el fin de hacer una “simulación por ordenador” del genoma.

Futuro de la citogenética

Los avances actualmente se centran en la citogenética molecular, incluyendo técnicas como las matrices de hibridación de genómica comparativa, CGH, matriz-SNP basada en cariotipos y sistemas automatizados para contabilizar los resultados de preparaciones estándar de FISH.

Véase también

Referencias

1. ^ Stedman's Medical Dictionary (28th Ed.). (2006). Baltimore, MD: Lippincott Williams.

2. ^ Levitsky G.A. 1924. The material basis of heredity. State Publication Office of the Ukraine, Kiev. [in Russian]

3. ^ Levitsky G.A. 1931. The morphology of chromosomes. Bull. Applied Bot. Genet. Plant Breed. 27, 19-174.

4. ^ Kottler M. 1974. From 48 to 46: cytological technique, preconception and the counting of the human chromosomes. Bull. Hist. Med. 48, 465-502.

5. ^ von Winiwarter H. 1912. Études sur la spermatogenese humaine. Arch. biologie 27, 93, 147-9.

6. ^ Painter T.S. 1922. The spermatogenesis of man. Anat. Res. 23, 129.

7. ^ Painter T.S. 1923. Studies in mammalian spermatogenesis II. The spermatogenesis of man. J. Exp. Zoology 37, 291-336.

8. ^ Tjio J.H & Levan A. 1956. The chromosome number of man. Hereditas 42, 1-6.

9. ^ Hsu T.C. Human and mammalian cytogenetics: a historical perspective. Springer-Verlag, N.Y.

10. ^ Painter T.S. 1933. A new method for the study of chromosome rearrangements and the plotting of chromosome maps. Science 78: 585-586.

11. ^ Dobzhansky T. 1951. Genetics and the origin of species. 3rd ed, Columbia University Press, New York.

12. ^ Dobzhansky T. 1970. Genetics of the evolutionary process. Columbia University Press N.Y.

13. ^ [Dobzhansky T.] 1981. Dobzhansky's genetics of natural populations. eds Lewontin RC, Moore JA, Provine WB and Wallace B. Columbia University Press N.Y.

14. ^ Lejeune J, Gautier M, Turpin MR. Etude des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. C R Acad Sci (Paris) 1959;248:1721-2.

15. ^ Nowell PC, Hungerford DA. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia. Science 1960;132:1497-1501.

16. ^ Lacadena, J.R. (1996) Citogenética. Editorial Complutense.

17. ^ Klug WS, Cummings MR, Spencer CA. Conceptos de Genética (8ª edición). (2008).

Enlaces externos

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 Hasta mediados de los años 50 no fue generalmente aceptado que el cariotipo del hombre incluía sólo 46 cromosomas.[8][9] Y algo muy importante, los grandes primates tenían 48 cromosomas.
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