Discusión:Agrobacterium
Rubenaf 20071016
¿Qué os parece modificar un poco el artículo?[editar]
Veréis, hice mi tesis doctoral con agrobacterium y gracias a ello tengo una amplia introducción llena de referencias bibliográficas. Me gustaría que me diérais vuestra opinión acerca de si merece la pena incluirlo en este artículo (lo pongo todo para que le echéis un ojo, pero desde luego hay partes que no creo que deban incluirse porque son demasiado técnicas, y desde luego tendré que adaptarlo porque tiene demasiadas referencias bibliográficas). De todos modos, creo que merece la pena pulir algunos detalles en este artículo que no están claros. Saludos.
Ahí va el texto:
Agrobacterium
El género Agrobacterium pertenece a la familia Rhizobiaceae. El género se divide en biovares, según características de crecimiento y metabólicas: la mayoría de las cepas de A. tumefaciens y A. rubi se agrupan en el biovar I, A. rhizogenes en el biovar II y A. vitis en el biovar III (Gelvin 2003). El fitopatógeno Agrobacterium tumefaciens, una bacteria Gram negativa del suelo, comien-za a estudiarse en 1907 cuando, como Bacterium tumefaciens, se identifica como el causante de la enfermedad de la agalla en corona (Smith y Townsend 1907). Cuatro décadas más tarde se propone que este microorganismo es la causa de un «principio inductor de tumores», posiblemente ADN, que altera las células permanentemente hacia una división activa (Braun 1947, Braun y Mandle 1948). La naturaleza de ese «principio transformante», sin embargo, no puede determinarse hasta la llegada de las técnicas moleculares, que permiten demostrar que un cultivo axénico de agallas con-tiene ADN de origen bacteriano (Schilperoort et al. 1967). En la siguiente década, los estudios genéticos conducen al descubrimiento de que la tumori-génesis depende de un tipo particular de plásmidos, los Ti (Tumor-inducing, encontrados en A. tu-mefaciens) (Van Larebeke et al. 1974), y tiempo más tarde también se incluyen a los Ri (Rhizoge-nesis-inducing, encontrados en A. rhizogenes) dentro de ese grupo. Más aún, se demuestra que sólo una región de tales plásmidos, el ADN-T (ADN transferido), se transfiere de Agrobacterium al hos-pedador (Chilton et al. 1977, 1978, Depicker et al. 1978). (Para información adicional, consúltese la revisión de Zupan 2000).
El ADN-T se localiza entre dos repeticiones imperfectas de 25 pb denominadas bordes de-recho (RB, right border, en posición 5’) e izquierdo (LB, left border, en posición 3’), y puede susti-tuirse por un ADN foráneo. La transferencia normalmente comienza por el RB y finaliza en el LB, pero diversos estudios han demostrado que este sistema no es totalmente preciso: por una parte, la transferencia puede interrumpirse antes de llegar al LB; por otra, en el genoma receptor se ha detec-tado la presencia de secuencias adyacentes al ADN-T que se transfieren juntamente a éste, debido a que al separar el ADN-T del vector, la nucleasa VirD1/VirD2 ignora a veces el LB o la transferencia comienza en sentido LB > RB (De Buck et al. 2000, Kononov et al. 1997, Kuraya et al. 2004).
Los productos de los genes de virulencia (vir) localizados en los plásmidos Ti coordinan el procesamiento del ADN-T y su transferencia a las células vegetales. La expresión de estos genes está controlada por un sistema de dos componentes formado por virA y virG, que conforman un sistema regulador de transducción de señales. La proteína VirA es una antena periplásmica que detecta la presencia de compuestos fenólicos vegetales particulares que se inducen y excretan en las heridas. Coordinándose con el transportador de monosacáridos ChvE y en presencia de las molécu-las de fenoles y azúcares apropiadas, VirA se autofosforila y a continuación transfosforila a la pro-teína VirG. Ésta es inactiva en su forma defosforilada, pero tras recibir el fosfato de VirA es capaz de activar o aumentar el nivel de transcripción de los genes vir, probablemente mediante una inter-acción con las secuencias «vir-box» —una inducción génica eficiente de los genes vir necesita un pH ácido, una concentración alta de monosacáridos y la presencia de inductores fenólicos como la acetosiringona (Gelvin 2003)—. Las proteínas VirA o VirG constitutivamente activas que no re-quieren fenoles para activarse, así como las proteínas VirG que interaccionan con más efectividad con las secuencias «vir-box» para activar la expresión génica, pueden ser útiles para aumentar la eficiencia de transformación o el rango de húesped de Agrobacterium; a este respecto, Pazour et al. (1992) descubrieron dos mutantes de virG que funcionaban independientemente de agentes inducto-res, produciendo un aumento en la eficiencia de transformación genética: uno de ellos era una susti-tución de la asparagina-54 por un aspartato (gen virGN54D), y el otro una sustitución de la isoleu-cina-106 por una leucina (virGI106L). El mutante virGN54D ha mostrado ser efectivo, entre otros, en casos recalcitrantes de Oryza indica y Glycine max (Ke et al. 2001), así como en Catharanthus roseus (Van der Fits et al. 2000). También existen otros mutantes como virGI77V (sustitución de la isoleucina-77 por una valina), que apenas presenta actividad en ausencia de acetosiringona, pero que alcanza la actividad máxima en presencia de bajas concentraciones de ésta (Scheeren-Groot et al. 1994).
Para que haya transferencia de material genético entre Agrobacterium y la célula vegetal es necesario que exista un contacto estrecho entre ambas. Para ello, la bacteria ensambla un pilus a partir de la proteína VirD4 y las once proteínas VirB conocidas. Este pilus es un sistema de secre-ción tipo IV, y es necesario para la transferencia del ADN-T a plantas y levaduras. No obstante su función concreta no está clara: puede actuar como transportador, o bien como un sistema que permi-te la sujeción de la bacteria a la célula a la que va a transferir el material genético (referencias en Gelvin 2003, Zupan et al. 2000).
La mayoría de experimentos de transformación se realizan empleando la temperatura de in-ducción máxima de los genes vir, de 25-27 ºC. Sin embargo, hay un aspecto de la biología del pilus que puede resultar interesante en la transformación: su termolabilidad. El pilus de algunas cepas de Agrobacterium es más estable a temperaturas de 18-20 ºC (referencias en Gelvin 2003), y a más de 28 ºC, según el modelo propuesto por Banta et al. (1998), no puede ensamblarse debido a la falta de estabilidad de VirB10; lo que explicaría que tras cocultivar por encima de esta temperatura no se haya detectado transformación genética con la mayoría de las cepas.
Transformación genética
Existen dos grandes grupos de métodos de transferencia genética: los indirectos y los directos. Los indirectos consisten en una introducción mediada del ADN en las células empleando virus o bacterias como Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes, Sinorhizobium meliloti 1021, Rhizo-bium sp. NGR234 o Mesorhizobium loti MAFF3099 (Broothaerts et al. 2005). Los directos, en cambio, permiten transferir el ADN por medios físicos o químicos sin necesidad de intermediarios biológicos (e.g. biobalística, cloruro de calcio, electroforesis de embriones, electroporación, infiltra-ción, liposomas, microinyección, PTP —pollen-tube pathway—, SCMT —silicon carbide-mediated transformation—, shock térmico, etc.) (Rakoczy-Trojanowska 2002).
Los estudios acerca de Agrobacterium y la capacidad para transferir ADN de un organismo a otro han supuesto una revolución. Uno de los logros más importantes en ingeniería genética, rela-cionado con la manipulación práctica de Agrobacterium, se alcanza cuando Zambryski et al. (1983) consiguen transformar plantas de tabaco utilizando un ADN-T desarmado, convirtiendo así a la bacteria patógena en un vector y en uno de los pilares actuales de la ingeniería genética vegetal. Sólo A. tumefaciens y A. rhizogenes se emplean en transformación genética, y se ha obser-vado que tienen un rango de huésped más grande de lo que se pensaba en un principio, que se am-plía año a año. Sutiles modificaciones en el genoma bacteriano, unidas a la elección adecuada de las cepas, han permitido transferir ADN a angiospermas, gimnospermas, hongos, e incluso células humanas (referencias en Gelvin 2003). Y casi un siglo después de que esta bacteria se viera a la luz de la ciencia, todavía queda mucho, mucho más por conocer acerca de ella.
Inicialmente se usaron como vectores plasmídicos los sistemas cointegrativos, en los que un solo plásmido obtenido por recombinación contiene los genes vir y el ADN-T. Sin embargo, un segundo hallazgo revolucionó los sistemas de transformación: los genes de virulencia de los plás-midos Ti y Ri, necesarios para la transferencia, pueden funcionar en trans para procesar y movilizar el ADN-T presente en otro plásmido (Bevan 1984, De Framond et al. 1983, Hoekema et al. 1983). Partiendo de este conocimiento se han desarrollado los sistemas binarios, que como dice su nombre constan de dos plásmidos: el Ti, que aporta los genes de virulencia, y el conocido como binario, que porta un ADN-T con varios orígenes de replicación (de E. coli y A. tumefaciens), sitios de clonación y un gen marcador y/o seleccionable, entre otras modificaciones (Scott Grayburn 1997). Los plás-midos binarios aportan las ventajas de que, aun siendo menos estables que los vectores cointegrati-vos, son más pequeños y fáciles de manipular, y pueden replicarse en E. coli y Agrobacterium in-distintamente (Hood et al. 1993, Klee et al. 1987).
Gracias a los avances citados, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium es uno de los sistemas más utilizados para la transformación de plantas. No obstante, como ya se comentó, el grado de éxito de este sistema depende de dos factores esenciales (Birch 1997, Potrykus 1991): un tejido que presente células competentes para la regeneración de planta y susceptibles de ser transformadas, así como un procedimiento para seleccionar las células transformadas y regenerar plantas transgénicas con una eficiencia satisfactoria.