Diferencia entre revisiones de «Fago M13»
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El '''fago M13''' es un [[bacteriófago]] filamentoso compuesto por una única molécula de ADN monocatenario circular la cual tiene aproximadamente 6407 nucleótidos de longitud; esta molécula se encuentra encapsulada en una cubierta proteica formada por aproximadamente 2700 copias de la proteína mayor de recubrimiento P8, y encapuchada en los extremos por cinco copias de dos diferentes proteínas de recubrimiento menores (P9, P6, P3). La proteína de recubrimiento menor P3 permite que el fago se una a un receptor presente en la punta de los [[pilus|pilli]] del hospedador ''[[Escherichia coli]]''. La infección con bacteriófagos filamentosos no es letal para las bacterias; sin embargo la infección causa placas turbias en los cultivos de ''E. coli''. Aunque no se trata de un virus lítico, si se ha observado una disminución en la velocidad de reproducción de las células infectadas. Los [[plásmido]]s M13 llamados [[fagémido]]s son utilizados en numerosos procesos de recombinación de ADN, y el virus ha sido estudiado por las posibles aplicaciones en [[nanoestructura]]s y [[nanotecnología]] de los principios que dominan su proceso de encapsulamiento. |
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El '''fago M13''' es un [[bacteriófago]] filamentoso, está formado por una molécula de ADN de cadena sencilla y una cubierta proteica, este fago es específico de bacterias "masculinas" porque penetra en la célula huésped a través de los [[pilus]]. |
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==Phage particles== |
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The phage coat is primarily assembled from a 50 [[amino acid]] [[protein]] called pVIII (or p8), which is encoded by [[gene]] VIII (or g8) in the phage [[genome]]. For a [[wild type]] M13 particle, it takes approximately 2700 copies of p8 to make the coat about 900 nm long. The coat's dimensions are flexible though and the number of p8 copies adjusts to accommodate the size of the single stranded genome it packages. For example, when the phage genome was mutated to reduce its number of DNA bases (from 6.4 kb to 221 bp) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=1469710&query_hl=1&itool=pubmed_docsum], then the number of p8 copies was decreased to fewer than 100, causing the p8 coat to shrink in order to fit the reduced genome. The phage appear to be limited at approximately twice the natural DNA content. However, deletion of a phage protein (p3) prevents full escape from the host ''E. coli'', and phage that are 10-20X the normal length with several copies of the phage genome can be seen shedding from the ''E. coli'' host. |
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There are four other proteins on the phage surface, two of which have been extensively studied. At one end of the filament are five copies of the surface exposed pIX (p9) and a more buried companion protein, pVII (p7). If p8 forms the shaft of the phage, p9 and p7 form the "blunt" end that is seen in the micrographs. These proteins are very small, containing only 33 and 32 amino acids respectively, though some additional residues can be added to the N-terminal portion of each which are then presented on the outside of the coat. At the other end of the phage particle are five copies of the surface exposed pIII (p3) and its less exposed accessory protein, pVI (p6). These form the rounded tip of the phage and are the first proteins to interact with the ''E. coli'' host during infection. p3 is also the last point of contact with the host as new phage bud from the bacterial surface. |
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==Phage life-cycle== |
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The general stages to a viral life cycle are: infection, replication of the viral genome, assembly of new viral particles and then release of the progeny particles from the host. Filamentous phage use a bacterial structure known as the F pilus to infect ''E. coli'', with the M13 p3 tip contacting the TolA protein on the bacterial pilus. The phage genome is then transferred to the cytoplasm of the bacterial cell where resident proteins convert the single stranded DNA genome to a double stranded replicative form ("RF"). This DNA then serves as a template for expression of the phage genes. |
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Two phage gene products play critical roles in the next stage of the phage life cycle, namely amplification of the genome. pII (aka p2) nicks the double stranded form of the genome to initiate replication of the + strand. Without p2, no replication of the phage genome can occur. Host [[enzymes]] copy the replicated + strand, resulting in more copies of double stranded phage DNA. pV (aka p5) competes with double stranded DNA formation by sequestering copies of the + stranded DNA into a protein/DNA complex destined for packaging into new phage particles. Interestingly there is one additional phage-encoded protein, pX (p10), that is important for regulating the number of double stranded genomes in the bacterial host. Without p10 no + strands can accumulate. What's particularly interesting about p10 is that it's identical to the [[C-terminal]] portion of p2 since the gene for p10 is within the gene for p2 and the protein arises from [[Transcription (genetics)|transcription]] initiation within gene 2. This makes the manipulation of p10 inextricably linked to manipulation of p2 (an engineering headache) but it also makes for a compact and efficient phage in nature. |
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Phage maturation requires the phage-encoded proteins pIV (p4), pI (p1) and its translational restart product pXI (p11). Multiple copies (on the order of 12 or 14) of p4 assemble in the outer membrane into a stable, i.e. detergent resistant, barrel-shaped structure. Similarly a handful of the p1 and p11 proteins (5 or 6 copies of each) assemble in the bacterial inner membrane, and genetic evidence suggests C-terminal portions of p1 and p11 interact with the [[N-terminal]] portion of p4 in the periplasm. Together the p1, p11, p4 complex forms channels through which mature phage are secreted from the bacterial host. |
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To initiate phage secretion, two of the minor phage coat proteins, p9 and p7, are thought to interact with the p5-single stranded DNA complex at a region of the DNA called the packaging sequence (aka PS). The p5 proteins covering the single stranded DNA are then replaced by p8 proteins that are embedded in the [[Cell membrane|bacterial membrane]] and the growing phage filament is threaded through the p1, p11, p4 channel. This replacement of p5 by p8 explains the microphage data presented earlier indicate how the size of the phage particle is determined by the number of bases the phage packages. Once the phage DNA has been fully coated with p8, the secretion terminates by adding the p3/p6 cap, and the new phage detaches from the bacterial surface. |
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==Replication in ''E. coli''== |
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Below are steps involved with replication of M13 in ''E. coli''. |
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* Viral (+) strand DNA enters [[cytoplasm]] |
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* [[Complementary DNA|Complementary (-) strand]] is synthesized by bacterial enzymes |
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* [[DNA Gyrase]], a [[type II topoisomerase]], acts on [[dsDNA|double-stranded DNA]] and catalyzes formation of [[DNA supercoil|negative supercoils]] in double-stranded DNA |
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* Final product is parental replicative form (RF) DNA |
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* A phage protein, pII, nicks the (+) strand in the RF |
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* 3'-hydroxyl acts as a primer in the creation of new viral strand |
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* pII circulizes displaced viral (+) strand DNA |
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* Pool of progeny double-stranded RF molecules produced |
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* Negative strand of RF is template of transcription |
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* mRNAs are translated into the phage proteins |
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Phage proteins in the cytoplasm are pII, pX, and pV, and they are part of the replication process of DNA. The other phage proteins are synthesized and inserted into the cytoplasmic or outer membranes. |
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* pV dimers bind newly synthesized single-stranded DNA and prevent conversion to RF DNA |
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* RF DNA synthesis continues and amount of pV reaches critical concentration |
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* DNA replication switches to synthesis of single-stranded (+) viral DNA |
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* pV-DNA structures from about 800 nm long and 8 nm in diameter |
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* pV-DNA complex is substrate in phage assembly reaction |
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==Research== |
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George Smith, among others, showed that fragments of EcoRI [[endonuclease]] could be fused in the unique Bam site of f1 filamentous phage and thereby expressed in gene III whose protein pIII was externally accessible. M13 does not have this unique Bam site in gene III. |
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M13 had to be engineered to have accessible insertion sites, making it limited in its flexibility in handling different sized inserts. |
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Because the M13 phage display system allows great flexibility in the location and number of recombinant proteins on the phage, it is a popular tool to construct or serve as a scaffold for nanostructures.<ref>{{Cite journal| doi = 10.1021/nl050795d| issn = 1530-6984| volume = 5| issue = 7| pages = 1429–1434| last = Huang| first = Yu| coauthors = Chung-Yi Chiang, Soo Kwan Lee, Yan Gao, Evelyn L. Hu, James De Yoreo, Angela M. Belcher| title = Programmable Assembly of Nanoarchitectures Using Genetically Engineered Viruses| journal = Nano Lett.| year = 2005}}</ref> For example, the phage can be engineered to have a different protein on each end and along its length. This can be used to assemble structures like gold or cobalt oxide nano-wires for batteries<ref>{{Cite journal| doi = 10.1126/science.1122716| issn = 0036-8075, 1095-9203| volume = 312| issue = 5775| pages = 885–888| last = Nam| first = Ki Tae| coauthors = Dong-Wan Kim, Pil J Yoo, Chung-Yi Chiang, Nonglak Meethong, Paula T Hammond, Yet-Ming Chiang, Angela M Belcher| title = Virus-Enabled Synthesis and Assembly of Nanowires for Lithium Ion Battery Electrodes| journal = Science| accessdate = 2012-03-23| date = 2006-05-12| url = http://www.sciencemag.org/content/312/5775/885| pmid=16601154}}</ref> or to pack carbon nanotubes into straight bundles for use in photovoltaics.<ref>{{Cite journal| doi = 10.1038/nnano.2011.50| issn = 1748-3387| volume = 6| issue = 6| pages = 377–384| last = Dang| first = Xiangnan| coauthors = Hyunjung Yi, Moon-Ho Ham, Jifa Qi, Dong Soo Yun, Rebecca Ladewski, Michael S. Strano, Paula T. Hammond, Angela M. Belcher| title = Virus-templated self-assembled single-walled carbon nanotubes for highly efficient electron collection in photovoltaic devices| journal = Nature Nanotechnology| accessdate = 2012-03-23| date = 2011-04-24| url = http://www.nature.com/nnano/journal/v6/n6/full/nnano.2011.50.html}}</ref> |
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==Links== |
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* 20.109(S07): Start-up Genome Engineering [http://openwetware.org/wiki/20.109(S07):Start-up_genome_engineering] |
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* Phage Display: A Laboratory Manual |
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*{{Citation |
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|pmid = 8220775 |
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|last=Messing |
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|first=J |
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|publication-date=1993 |
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|year=1993 |
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|title=M13 cloning vehicles. Their contribution to DNA sequencing. |
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|volume=23 |
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|issue= |
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|periodical=Methods Mol. Biol. |
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|pages=9–22 |
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|doi = 10.1385/0-89603-248-5:9 |
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|chapter = M13 Cloning Vehicles: Their Contribution to DNA Sequencing |
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|isbn = 0-89603-248-5 |
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}} [http://www.blogsua.com/pdf/dna-sequencing-protocols.pdf Included in ''DNA Sequencing Protocols'' by Griffin, Annette M.; Griffin , Hugh G. (large 21mb file)] |
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==See also== |
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*[[Phage display]] |
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*[[Phagemid]] |
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==Ciclo vital== |
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El [[fagémido]] es una molécula circular de ADN de doble cadena de plásmido que contiene un origen de replicación (ori V) y el origen de replicación de M13 pero que no contiene los genes que codifican para las proteínas estructurales del fago. En un fagémido se puede clonar una secuencia de ADN de interés que se desea que se exprese en una población de células mediante la explotación de la infección por fagos. Debido a que el fagémido contiene sólo el origen de replicación de fago, es incapaz de generar las proteínas estructurales necesarias para el ensamblaje del fago y para el empaquetamiento del ADN dentro de él. Por esta razón, se utiliza el fago auxiliar M13K07. Este fago contiene un origen de replicación y de codificación para todas las proteínas estructurales necesarias para el montaje de la forma infectiva del fago. Cuando las células que contienen el fagémido se [[superinfección|superinfectan]] con M13K07, la Gp2 producida por los genes del M13K07 reconoce como secuencia de origen de fago a la que se encuentra presente en el fagémido por lo que en consecuencia es capaz de replicarse y se empaquetarse junto con las proteínas estructurales codificadas por el fago auxiliar. |
El [[fagémido]] es una molécula circular de ADN de doble cadena de plásmido que contiene un origen de replicación (ori V) y el origen de replicación de M13 pero que no contiene los genes que codifican para las proteínas estructurales del fago. En un fagémido se puede clonar una secuencia de ADN de interés que se desea que se exprese en una población de células mediante la explotación de la infección por fagos. Debido a que el fagémido contiene sólo el origen de replicación de fago, es incapaz de generar las proteínas estructurales necesarias para el ensamblaje del fago y para el empaquetamiento del ADN dentro de él. Por esta razón, se utiliza el fago auxiliar M13K07. Este fago contiene un origen de replicación y de codificación para todas las proteínas estructurales necesarias para el montaje de la forma infectiva del fago. Cuando las células que contienen el fagémido se [[superinfección|superinfectan]] con M13K07, la Gp2 producida por los genes del M13K07 reconoce como secuencia de origen de fago a la que se encuentra presente en el fagémido por lo que en consecuencia es capaz de replicarse y se empaquetarse junto con las proteínas estructurales codificadas por el fago auxiliar. |
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==Referencias== |
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[[en:M13 bacteriophage]] |
[[en:M13 bacteriophage]] |
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Revisión del 18:47 8 dic 2012
El fago M13 es un bacteriófago filamentoso compuesto por una única molécula de ADN monocatenario circular la cual tiene aproximadamente 6407 nucleótidos de longitud; esta molécula se encuentra encapsulada en una cubierta proteica formada por aproximadamente 2700 copias de la proteína mayor de recubrimiento P8, y encapuchada en los extremos por cinco copias de dos diferentes proteínas de recubrimiento menores (P9, P6, P3). La proteína de recubrimiento menor P3 permite que el fago se una a un receptor presente en la punta de los pilli del hospedador Escherichia coli. La infección con bacteriófagos filamentosos no es letal para las bacterias; sin embargo la infección causa placas turbias en los cultivos de E. coli. Aunque no se trata de un virus lítico, si se ha observado una disminución en la velocidad de reproducción de las células infectadas. Los plásmidos M13 llamados fagémidos son utilizados en numerosos procesos de recombinación de ADN, y el virus ha sido estudiado por las posibles aplicaciones en nanoestructuras y nanotecnología de los principios que dominan su proceso de encapsulamiento.
Ciclo vital
El fago M13 se adsorbe en el pilus por medio de la proteína de la cápside GP3. La hebra de ADN que penetra en la célula es de cadena sencilla y se llama "hebra +". Una vez introducido en el ADN de la célula se convierte en una molécula circular de doble cadena llamada "forma replicativa" (FR). El ADN doble cadena se replica varias veces y al mismo tiempo son transcriptos los genes que codifican las proteínas estructurales del fago. Una vez que se alcanzaron unas 100-200 copias del ADN del fago, el producto del gen 5 (GP5) se une a la cadena simple + (hebra +) y evita que se continúe replicando. Las hebras de ADN de esta forma quedan habilitadas para interaccionar con la membrana celular a través de las glicoproteinas de la cápside GP7 y GP9 y una vez hecho el contacto, GP5 se sustituye por GP8 y GP3. Los fagos así montados se extruyen de la pared de la célula sin lisarla.
Replicación del Genoma
El ADN de fago que entra en la célula es de cadena sencilla y se llama "hebra +". Apenas penetra en la célula, la ARN polimerasa de la célula hospedadora sintetiza un cebador en el origen de replicación. La ADN polimerasa de la célula hospedadora empieza a sintetizar la cadena complementaria que se denomina "hebra -". Cuando la Pol III encuentra el cebador se disocia del ADN. Luego la ADN Pol I con actividad exonucleasa 5'elimina el cebador y llena la brecha. Finalmente la ligasa suelda los dos tramos de ADN recién sintetizados. La síntesis de la cadena - da lugar a un ADN de doble cadena llamado "forma replicativa". Las dos cadenas - y + de la forma replicativa son luego replicadas por separado por dos mecanismos diferentes. El producto del gen 2 es una endonucleasa que produce una muesca en el filamento de la FR + y permanece unido al fosfato en el extremo 5' dejando el extremo 3' libre. La proteína Rep del huésped es una helicasa que ayuda a desenredar el ADN en el punto donde se encuentra la muesca. La ADN Pol III del anfitrión utiliza extremo 3' libre como un cebador para la síntesis de una nueva hebra +, mientras que la vieja se quita. Una vez completada la replicación se obtienen dos moléculas de ADN: una circular de doble cadena y una de cadena sencilla, sobre esta última actúa la proteina Gp2 soldando el extremo 5 'y 3' por medio de una reacción de transesterificación recreando de esta forma una hebra +. Este proceso continúa hasta que se empieza a acumular GP5. Esta proteína se une al ADN de cadena sencilla + y evita que se siga replicando.
M13 como vector de clonación
Dado que el ADN de M13 es monocatenario, este bacteriófago es un vector conveniente para la clonación de ADN. La longitud de su genoma no es fijo y por lo tanto es capaz de aceptar ADN extraño sin comprometer la viabilidad del fago. Un vector de clonación particular que explota el ciclo de vida del fago M13 se llama "fagémido".
El fagémido es una molécula circular de ADN de doble cadena de plásmido que contiene un origen de replicación (ori V) y el origen de replicación de M13 pero que no contiene los genes que codifican para las proteínas estructurales del fago. En un fagémido se puede clonar una secuencia de ADN de interés que se desea que se exprese en una población de células mediante la explotación de la infección por fagos. Debido a que el fagémido contiene sólo el origen de replicación de fago, es incapaz de generar las proteínas estructurales necesarias para el ensamblaje del fago y para el empaquetamiento del ADN dentro de él. Por esta razón, se utiliza el fago auxiliar M13K07. Este fago contiene un origen de replicación y de codificación para todas las proteínas estructurales necesarias para el montaje de la forma infectiva del fago. Cuando las células que contienen el fagémido se superinfectan con M13K07, la Gp2 producida por los genes del M13K07 reconoce como secuencia de origen de fago a la que se encuentra presente en el fagémido por lo que en consecuencia es capaz de replicarse y se empaquetarse junto con las proteínas estructurales codificadas por el fago auxiliar.