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Diferencia entre revisiones de «Espectroscopia mediante resonancia magnética nuclear de proteínas»

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=== Homonuclear nuclear magnetic resonance ===
=== Homonuclear nuclear magnetic resonance ===
With unlabelled protein the usual procedure is to record a set of two dimensional homonuclear nuclear magnetic resonance experiments through [[correlation spectroscopy]] (COSY), of which several types include conventional correlation spectroscopy, ''total correlation'' spectroscopy (TOCSY) and [[nuclear Overhauser effect]] spectroscopy (NOESY).{{ref|wuthrich}} A two-dimensional nuclear magnetic resonance experiment produces a two-dimensional spectrum. The units of both axes are chemical shifts. The COSY and TOCSY transfer magnetization through the chemical bonds between adjacent protons. The conventional correlation spectroscopy experiment is only able to transfer magnetization between protons on adjacent atoms, whereas in the total correlation spectroscopy experiment the protons are able to relay the magnetization, so it is transferred among all the protons that are connected by adjacent protons. Thus in a conventional correlation spectroscopy, an alpha proton transfers magnetization to the beta protons, the beta protons transfers to the alpha and gamma protons, if any are present, then the gamma proton transfers to the beta and the delta protons, and the process continues. In total correlation spectroscopy, the alpha and all the other protons are able to transfer magnetization to the beta, gamma, delta, epsilon if they are connected by a continuous chain of protons. The continuous chain of protons are the sidechain of the individual [[amino acid]]s. Thus these two experiments are used to build so called spin systems, that is build a list of resonances of the chemical shift of the peptide proton, the alpha protons and all the protons from each [[residue]]’s sidechain. Which chemical shifts corresponds to which nuclei in the spin system is determined by the conventional correlation spectroscopy connectivities and the fact that different types of protons have characteristic chemical shifts. To connect the different spinsystems in a sequential order, the nuclear Overhauser effect spectroscopy experiment have to be used. Because this experiment transfers magnetization through space, it will show crosspeaks to all protons that are close in space regardless of whether they are in the same spin system or not. The neighbouring residues are inherently close in space, so the assignments can be made by the peaks in the NOESY with other spin systems.
With unlabelled protein the usual procedure is to record a set of two dimensional homonuclear nuclear magnetic resonance experiments through [[correlation spectroscopy]] (COSY), of which several types include conventional correlation spectroscopy, ''total correlation'' spectroscopy (TOCSY) and [[nuclear Overhauser effect]] spectroscopy (NOESY).<ref>{{cita publicación |apellidos=Wüthrich, K. |año=25 de diciembre de 1990 |título=Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy |publicación=Journal of chemical biology |volumen=265 |número=36 |páginas=22059-22062 |ubicación=Berlín, Alemania |editorial=Institut für Molekularbiologie und Biophysik |issn=1864-6166 |pmid=2266107 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2266107 |idioma=inglés}}</ref> A two-dimensional nuclear magnetic resonance experiment produces a two-dimensional spectrum. The units of both axes are chemical shifts. The COSY and TOCSY transfer magnetization through the chemical bonds between adjacent protons. The conventional correlation spectroscopy experiment is only able to transfer magnetization between protons on adjacent atoms, whereas in the total correlation spectroscopy experiment the protons are able to relay the magnetization, so it is transferred among all the protons that are connected by adjacent protons. Thus in a conventional correlation spectroscopy, an alpha proton transfers magnetization to the beta protons, the beta protons transfers to the alpha and gamma protons, if any are present, then the gamma proton transfers to the beta and the delta protons, and the process continues. In total correlation spectroscopy, the alpha and all the other protons are able to transfer magnetization to the beta, gamma, delta, epsilon if they are connected by a continuous chain of protons. The continuous chain of protons are the sidechain of the individual [[amino acid]]s. Thus these two experiments are used to build so called spin systems, that is build a list of resonances of the chemical shift of the peptide proton, the alpha protons and all the protons from each [[residue]]’s sidechain. Which chemical shifts corresponds to which nuclei in the spin system is determined by the conventional correlation spectroscopy connectivities and the fact that different types of protons have characteristic chemical shifts. To connect the different spinsystems in a sequential order, the nuclear Overhauser effect spectroscopy experiment have to be used. Because this experiment transfers magnetization through space, it will show crosspeaks to all protons that are close in space regardless of whether they are in the same spin system or not. The neighbouring residues are inherently close in space, so the assignments can be made by the peaks in the NOESY with other spin systems.


One important problem using homonuclear nuclear magnetic resonance is [[overlap]] between peaks. This occurs when different protons have the same or very similar chemical shifts. This problem becomes greater as the protein becomes larger, so homonuclear nuclear magnetic resonance is usually restricted to small proteins or peptides.
One important problem using homonuclear nuclear magnetic resonance is [[overlap]] between peaks. This occurs when different protons have the same or very similar chemical shifts. This problem becomes greater as the protein becomes larger, so homonuclear nuclear magnetic resonance is usually restricted to small proteins or peptides.
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=== Carbon-13 and nitrogen-15 nuclear magnetic resonance ===
=== Carbon-13 and nitrogen-15 nuclear magnetic resonance ===
When the protein is labelled with carbon-13 and nitrogen-15 it is possible to record an experiment that transfers magnetisation over the peptide bond, and thus connect different spin systems through bonds. This is usually done using some of the following experiments, [[HNCO experiment|HNCO]], [[HNCACO experiment|HNCACO]], [[HNCA experiment|HNCA]],{{ref|hnca}} [[HNCOCA experiment|HNCOCA]], [[HNCACB experiment|HNCACB]] and [[CBCACONH experiment|CBCACONH]]. All six experiments consist of a HSQC plane expanded with a carbon dimension. In the HNCO the spectrum contains peaks at the chemical shifts of the carbonyl carbons in the residue of the HSQC peak and the previous one in the sequence. The HNCACO only contains the one from the previous residue, and it is thus possible to assign the carbonyl carbon shifts that corresponds to each HSQC peak and the one previous to that one. Thus it is possible to make the assignment by matching the shifts of each spin system's own and previous carbons. The HNCA and HNCOCA works similarly, just with the alpha carbons rather than the carbonyls, and the HNCACB and the CBCACONH contains both the alpha carbon and the beta carbon. Usually several of these experiments are required to resolve overlap in the carbon dimension. This procedure is usually less ambiguous than the NOESY based method, since it is based on through bond transfer. In the NOESY-based methods additional peaks that are close in space but not belonging to the sequential residues will appear confusing the assignment process. When the sequential assignment has been made it is usually possible to assign the sidechains using HCCH-TOCSY, which is basically a TOCSY experiment resolved in an additional carbon dimension.
When the protein is labelled with carbon-13 and nitrogen-15 it is possible to record an experiment that transfers magnetisation over the peptide bond, and thus connect different spin systems through bonds. This is usually done using some of the following experiments, [[HNCO experiment|HNCO]], [[HNCACO experiment|HNCACO]], [[HNCA experiment|HNCA]],<ref>{{cita publicación |apellidos=Bax, A. y Ikura, M. |año=mayo de 1991 |título=An efficient 3D NMR technique for correlating the proton and 15N backbone amide resonances with the alpha-carbon of the preceding residue in uniformly 15N/13C enriched proteins |publicación=Journal of biomolecular NMR |volumen=1 |número=1 |páginas=99-104 |ubicación=Leiden, Países Bajos |editorial=ESCOM Science Publishers |issn=1573-5001 |pmid=1668719 |oclc=24245932 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1668719 |idioma=inglés}}</ref> [[HNCOCA experiment|HNCOCA]], [[HNCACB experiment|HNCACB]] and [[CBCACONH experiment|CBCACONH]]. All six experiments consist of a HSQC plane expanded with a carbon dimension. In the HNCO the spectrum contains peaks at the chemical shifts of the carbonyl carbons in the residue of the HSQC peak and the previous one in the sequence. The HNCACO only contains the one from the previous residue, and it is thus possible to assign the carbonyl carbon shifts that corresponds to each HSQC peak and the one previous to that one. Thus it is possible to make the assignment by matching the shifts of each spin system's own and previous carbons. The HNCA and HNCOCA works similarly, just with the alpha carbons rather than the carbonyls, and the HNCACB and the CBCACONH contains both the alpha carbon and the beta carbon. Usually several of these experiments are required to resolve overlap in the carbon dimension. This procedure is usually less ambiguous than the NOESY based method, since it is based on through bond transfer. In the NOESY-based methods additional peaks that are close in space but not belonging to the sequential residues will appear confusing the assignment process. When the sequential assignment has been made it is usually possible to assign the sidechains using HCCH-TOCSY, which is basically a TOCSY experiment resolved in an additional carbon dimension.
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Un "pico de cruce" en un experimento [[NOESY]] indica proximidad espacial entre los dos núcleos. Cada pico puede convertirse, por tanto, en una distancia máxima entre los núcleos, normalmente entre 1,8 y 6 [[angstroms]]. La intensidad del pico es proporcional a la distancia elevada a -6, de modo que la distancia se determina de acuerdo a la intensidad del pico.
Un "pico de cruce" en un experimento [[NOESY]] indica proximidad espacial entre los dos núcleos. Cada pico puede convertirse, por tanto, en una distancia máxima entre los núcleos, normalmente entre 1,8 y 6 [[angstroms]]. La intensidad del pico es proporcional a la distancia elevada a -6, de modo que la distancia se determina de acuerdo a la intensidad del pico.


La asignación de picos puede realizarse manualmente, pero resulta mucho más efectivo automatizar esta tarea mediante programas computacionales como [[CYANA]]<ref name="Cyana">{{cita publicación |apellidos=Güntert, P. |año=2004 |título=Automated NMR structure calculation with CYANA |publicación=Methods in molecular biology |volumen=278 |páginas=353-378 |ubicación=Nueva Jersey, Estados Unidos |editorial=Humana Press |issn=1940-6029 |pmid=15318003 |oclc=24839341 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15318003 |idioma=inglés}}</ref> y [[ARIA (software)|ARIA]]/CNS.<ref name="Aria">{{cita publicación |apellidos=Rieping, W.; Habeck, M.; [[et álii|et ál.]] |año=febrero de 2007 |título=ARIA2: automated NOE assignment and data integration in NMR structure calculation |publicación=Bioinformatics |volumen=23 |número=3 |páginas=381-382 |ubicación=Oxford, Inglaterra |editorial=Oxford University Press |issn=1367-4811 |pmid=17121777 |oclc=38899833 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17121777 |idioma=inglés}}</ref>
La asignación de picos puede realizarse manualmente, pero resulta mucho más efectivo automatizar esta tarea mediante programas computacionales como [[CYANA]]{{ref|cyana}} y [[ARIA (software)|ARIA]]{{ref|aria2}}/CNS.


=== Restricciones de ángulos ===
=== Restricciones de ángulos ===

Las restricciones en los ángulos de torsión de los enlaces químicos, normalmente los ángulos psi y phi pueden generarse de dos modos:
Las restricciones en los ángulos de torsión de los enlaces químicos, normalmente los ángulos psi y phi pueden generarse de dos modos:
* Mediante la ecuación Karplus, para generar restricciones angulares a partir de las constantes de acoplamiento
* Mediante la ecuación Karplus, para generar restricciones angulares a partir de las constantes de acoplamiento
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[[Archivo:RDC and protein structure.png|thumb|300px|Las flechas azules representan la orientación del enlace N - H de enlaces peptídicos seleccionados. Mediante la orientación de un número suficiente de enlaces relativos al campo magnético externo, puede determinarse la estructura de la proteína. Tomado de PDB 1KBH.]]
[[Archivo:RDC and protein structure.png|thumb|300px|Las flechas azules representan la orientación del enlace N - H de enlaces peptídicos seleccionados. Mediante la orientación de un número suficiente de enlaces relativos al campo magnético externo, puede determinarse la estructura de la proteína. Tomado de PDB 1KBH.]]
Las moléculas del analito en una muestra pueden ordenarse parcialmente en relación al campo magnético del espectrómetro mediante la manipulación de las condiciones de la muestra. Las técnicas más comunes incluyen la adición de [[bacteriófago]]s o [[bicela]]s o la preparación de la muestra en un gel de poliacrilamida. Esto genera un entorno local que favorece ciertas orientaciones de moléculas no esféricas. Normalmente, en la RMN en solución el acoplamiento dipolar entre núcleos se promedia, debido al rápido tumbling de la molécula. El acoplamiento dipolar suele utilizarse en la RMN de estado sólido y proporciona información sobre la orientación relativa de los vectores de enlace en relación a un marco de referencia global. Típicamente, la orientación del vector N-H se determina en un experimento tipo HSQC. {{ref|rdc}}
Las moléculas del analito en una muestra pueden ordenarse parcialmente en relación al campo magnético del espectrómetro mediante la manipulación de las condiciones de la muestra. Las técnicas más comunes incluyen la adición de [[bacteriófago]]s o [[bicela]]s o la preparación de la muestra en un gel de poliacrilamida. Esto genera un entorno local que favorece ciertas orientaciones de moléculas no esféricas. Normalmente, en la RMN en solución el acoplamiento dipolar entre núcleos se promedia, debido al rápido tumbling de la molécula. El acoplamiento dipolar suele utilizarse en la RMN de estado sólido y proporciona información sobre la orientación relativa de los vectores de enlace en relación a un marco de referencia global. Típicamente, la orientación del vector N-H se determina en un experimento tipo HSQC.<ref>{{cita publicación |apellidos=Alba, E. y Tjandra, N. |año=2004 |título=Residual dipolar couplings in protein structure determination |publicación=Methods in molecular biology |volumen=278 |páginas=89-106 |ubicación=Nueva Jersey, Estados Unidos |editorial=Humana Press |issn=1940-6029 |pmid=15317993 |oclc=24839341 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15317993 |idioma=inglés}}</ref>


== Intercambio hidrógeno-deuterio ==
== Intercambio hidrógeno-deuterio ==
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== Cálculo de la estructura ==
== Cálculo de la estructura ==
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Las restricciones determinadas experimentalmente pueden ser utilizadas como input para el proceso de cálculo de la estructura tridimensional. Los programas computacionales, como [[CYANA]] o [[XPLOR-NIH]],<ref>{{cita publicación |apellidos=Schwieters, C.; Kuszewski, J.; Tjandra, N. y Clore, G. |año=enero de 2003 |título=The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package |publicación=Journal of magnetic resonance |volumen=160 |número=1 |páginas=65-73 |ubicación=San Diego, California |editorial=Academic Press |issn=1096-0856 |pmid=12565051 |oclc=35454788 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12565051?dopt=Abstract |idioma=inglés}}</ref> tratan de satisfacer tantas restricciones como sea posible, además de propiedades generales de las proteínas como la longitud de los enlaces y los ángulos. Los algoritmos convierten las restricciones experimentales y las propiedades generales de las proteínas en términos energéticos, y tratan de minimizar la energía. Este proceso resulta en un conjunto de estructuras que convergen si los datos son suficientes para dictar un plegamiento determinado.
[[Archivo:Ensemble of NMR structures.jpg|thumb|left|300px|La determinación de la estructura por RMN genera un conjunto de estructuras entre las cuales sólo unas pocas convergerán si los datos son suficientes para dictar un plegamiento específico. En estas estructures, es sólo el caso para una parte de la estructura. Obtenido de PDB 1SSU.]]

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Las restricciones determinadas experimentalmente pueden ser utilizadas como input para el proceso de cálculo de la estructura tridimensional. Los programas computacionales, como [[CYANA]] o [[XPLOR-NIH]],{{ref|xplor}}, tratan de satisfacer tantas restricciones como sea posible, además de propiedades generales de las proteínas como la longitud de los enlaces y los ángulos. Los algoritmos convierten las restricciones experimentales y las propiedades generales de las proteínas en términos energéticos, y tratan de minimizar la energía. Este proceso resulta en un conjunto de estructuras que convergen si los datos son suficientes para dictar un plegamiento determinado.


== Dinámica ==
== Dinámica ==
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== Espectrometría RMN de proteínas grandes ==
== Espectrometría RMN de proteínas grandes ==
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Traditionally nuclear magnetic resonance spectroscopy has been limited to relatively small proteins or protein domains. This is in part caused by problems resolving overlapping peaks in larger proteins, but this has been alleviated by the introduction of isotope labelling and multidimensional experiments. Another more serious problem is the fact that in large proteins the magnetization relaxes faster, which means there is less time to detect the signal. This in turn causes the peaks to become broader and weaker, and eventually disappear. Two techniques have been introduced to attenuate the relaxation: [[TROSY|transverse relaxation optimized spectroscopy]] (TROSY){{ref|pervushin}} and [[deuterium|deuteration]]{{ref|markus}} of proteins. By using these techniques it has been possible to study proteins in complex with the 900 kDa [[chaperone]] [[GroEL|GroES-GroEL]].{{ref|fiaux}}
Traditionally nuclear magnetic resonance spectroscopy has been limited to relatively small proteins or protein domains. This is in part caused by problems resolving overlapping peaks in larger proteins, but this has been alleviated by the introduction of isotope labelling and multidimensional experiments. Another more serious problem is the fact that in large proteins the magnetization relaxes faster, which means there is less time to detect the signal. This in turn causes the peaks to become broader and weaker, and eventually disappear. Two techniques have been introduced to attenuate the relaxation: [[TROSY|transverse relaxation optimized spectroscopy]] (TROSY)<ref>{{cita publicación |apellidos=Pervushin, K.; Riek, R.; Wider, G. y Wüthrich, K. |año=11 de noviembre de 1997 |título=Attenuated T2 relaxation by mutual cancellation of dipole-dipole coupling and chemical shift anisotropy indicates an avenue to NMR structures of very large biological macromolecules in solution |publicación=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America |volumen=94 |número=23 |páginas=12366-12371 |ubicación=Washington DC, Estados Unidos |editorial=National Academy of Sciences |issn=1091-6490 |pmid=9356455 |oclc=01607201 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9356455?dopt=Abstract |idioma=inglés}}</ref> and [[deuterium|deuteration]]<ref>{{cita publicación |apellidos=Markus, M.; Dayie, K.; Matsudaira, P. y Wagner, G. |año=octubre de 1994 |título=Effect of deuteration on the amide proton relaxation rates in proteins. Heteronuclear NMR experiments on villin 14T |publicación=Journal of magnetic resonance. Series B |volumen=105 |número=2 |páginas=192-195 |ubicación=San Diego, California |editorial=Academic Press |issn=1096-0872 |pmid=7952934 |oclc=26224244 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7952934 |idioma=inglés}}</ref> of proteins. By using these techniques it has been possible to study proteins in complex with the 900 kDa [[chaperone]] [[GroEL|GroES-GroEL]].<ref>{{cita publicación |apellidos=Fiaux, J.; Bertelsen, E.; Horwich, A. y Wüthrich, K. |año=11 de julio de 2002 |título=NMR analysis of a 900K GroEL GroES complex |publicación=Nature |volumen=418 |número=6894 |páginas=207-211 |ubicación=Londres, Reino Unido |editorial=Nature Publishing Group |issn=0028-0836 |pmid=12110894 |oclc=01586310 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12110894 |idioma=inglés}}</ref>
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== Automatización del proceso ==
== Automatización del proceso ==
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Structure determination by NMR has traditionally been a time consuming process, requiring interactive analysis of the data by a trained scientist. There has been a considerable interest in automating the process to increase the throughput of structure determination (See [[structural genomics]]). The two most time consuming processes are the resonance assignment and the NOE assignment. Several different computer programs have been published that do this processes automatically.{{ref|cyana}}{{ref|aria}} Efforts have also been made to standardize the structure calculation protocol to make it quicker and more amenable to automation.{{ref|liu}}
Structure determination by NMR has traditionally been a time consuming process, requiring interactive analysis of the data by a trained scientist. There has been a considerable interest in automating the process to increase the throughput of structure determination (See [[structural genomics]]). The two most time consuming processes are the resonance assignment and the NOE assignment. Several different computer programs have been published that do this processes automatically.<ref name="Cyana" /><ref name="Aria" /> Efforts have also been made to standardize the structure calculation protocol to make it quicker and more amenable to automation.<ref>{{cita publicación |apellidos=Liu, G.; Shen, Y.; Atreya, H.; Parish, D.; [[et álii|et ál.]] |año=26 de julio de 2005 |título=NMR data collection and analysis protocol for high-throughput protein structure determination |publicación=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America |volumen=102 |número=130 |páginas=10487-10492 |ubicación=Washington DC, Estados Unidos |editorial=National Academy of Sciences |issn=1091-6490 |pmid=16027363 |oclc=01607201 |url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16027363 |idioma=inglés}}</ref>
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== Referencias ==
== Referencias ==
{{listaref}}
=== Citas ===
# {{note|wuthrich}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=2266107&query_hl=33&itool=pubmed_docsum Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy] Wuthrich K. J Biol Chem. 1990 [[December 25]];265(36):22059-62
# {{note|cyana}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15318003&query_hl=17&itool=pubmed_docsum Automated NMR structure calculation with CYANA.] Guntert P. Methods Mol Biol. 2004;278:353-78.
# {{note|aria2}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=17121777&query_hl=1&itool=pubmed_docsum ARIA2: automated NOE assignment and data integration in NMR structure calculation.] Rieping W, Habeck M, Bardiaux B, Bernard A, Malliavin TE, Nilges M. Bioinformatics 2007;23:381-382.
# {{note|hnca}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=1668719&query_hl=19&itool=pubmed_DocSum An efficient 3D NMR technique for correlating the proton and 15N backbone amide resonances with the alpha-carbon of the preceding residue in uniformly 15N/13C enriched proteins.] Bax A, Ikura M. J Biomol NMR. 1991 May;1(1):99-104.
# {{note|rdc}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15317993&query_hl=38&itool=pubmed_docsum Residual dipolar couplings in protein structure determination.] de Alba E, Tjandra N. Methods Mol Biol. 2004;278:89-106
# {{note|xplor}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=12565051&query_hl=36&itool=pubmed_DocSum The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package.] Schwieters CD, Kuszewski JJ, Tjandra N, Clore GM. J Magn Reson. 2003 Jan;160(1):65-73
# {{note|pervushin}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=9356455&query_hl=10&itool=pubmed_DocSum Attenuated T2 relaxation by mutual cancellation of dipole-dipole coupling and chemical shift anisotropy indicates an avenue to NMR structures of very large biological macromolecules in solution.] Pervushin K, Riek R, Wider G, Wuthrich K. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 [[November 11]];94(23):12366-71.
# {{note|markus}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=7952934&query_hl=12&itool=pubmed_DocSum Effect of deuteration on the amide proton relaxation rates in proteins. Heteronuclear NMR experiments on villin 14T.] Markus MA, Dayie KT, Matsudaira P, Wagner G. J Magn Reson B. 1994 Oct;105(2):192-5
# {{note|viaux}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=12110894&query_hl=14&itool=pubmed_docsum NMR analysis of a 900K GroEL GroES complex.] Fiaux J, Bertelsen EB, Horwich AL, Wuthrich K. Nature. 2002 [[July 11]];418(6894):207-11.
# Guntert, P. See above
# Rieping, W. See above
# {{note|liu}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=16027363&query_hl=42&itool=pubmed_docsum NMR data collection and analysis protocol for high-throughput protein structure determination.] Liu G, Shen Y, Atreya HS, Parish D, Shao Y, Sukumaran DK, Xiao R, Yee A, Lemak A, Bhattacharya A, Acton TA, Arrowsmith CH, Montelione GT, Szyperski T. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 [[July 26]];102(30):10487-92.


== Bibliografía ==
=== Literatura relacionada ===
* Gordon S. Rule, T. Kevin Hitchens (2006). "Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy". Springer. ISBN 1-4020-3499-7. http://www.springer.com/1-4020-3499-7
* Gordon S. Rule, T. Kevin Hitchens (2006). "Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy". Springer. ISBN 1-4020-3499-7. http://www.springer.com/1-4020-3499-7
* Quincy Teng, (2005). "Structural Biology, Practical NMR Applications, Springer, ISBN 0-387-24367-4
* Quincy Teng, (2005). "Structural Biology, Practical NMR Applications, Springer, ISBN 0-387-24367-4
Línea 111: Línea 96:
* Kurt Wuthrich (1986) ''NMR of Proteins and Nucleic Acids ''. Wiley-Interscience. ISBN 0-471-82893-9
* Kurt Wuthrich (1986) ''NMR of Proteins and Nucleic Acids ''. Wiley-Interscience. ISBN 0-471-82893-9


=== Enlaces relacionados ===
== Enlaces externos ==
* [http://www.voxelart.net/SimuSPIN/SimuSPIN.zip Herramienta Didáctica para el Estudio de los Principios Físicos de la Imagen por Resonancia Magnética]
* [http://www.voxelart.net/SimuSPIN/SimuSPIN.zip Herramienta Didáctica para el Estudio de los Principios Físicos de la Imagen por Resonancia Magnética]
* [http://www.natureprotocols.com/2006/11/09/noesybased_strategy_for_assign.php NOESY-Based Strategy for Assignments of Backbone and Side Chain Resonances of Large Proteins without Deuteration (a protocol)]
* [http://www.natureprotocols.com/2006/11/09/noesybased_strategy_for_assign.php NOESY-Based Strategy for Assignments of Backbone and Side Chain Resonances of Large Proteins without Deuteration (a protocol)]

Revisión del 00:16 15 dic 2010

Archivo:Pacific Northwest National Laboratory 800 MHz NMR Spectrometer.jpg
Introducción de la muestra en el espectrómetro RMN de alto campo magnético (800 MHz) del Pacific Northwest National Laboratory.

La espectroscopía mediante resonancia magnética nuclear de proteínas (usualmente llamada RMN de proteínas) es un campo de la biología estructural en el cual se utiliza espectroscopía RMN para obtener información sobre la estructura y dinámica de las proteínas. El campo fue desarrollado por Kurt Wüthrich, entre otros, quién compartió el premio Nobel de química en 2002. Las técnicas de RMN se utilizan en foma rutinaria en el ámbito académico y en la industria de biotecnología. La determinación de la estructura de las proteínas mediante espectroscopía RMN por lo general consiste en varias fases sucesivas, cada una de ellas utilizando un conjunto de técnicas altamente especializadas. La muestra es preparada, se asignan las resonancias, se generan las restricciones y se calcula y valida la estructura.

Preparación de la muestra

Colección de datos

Asignación de resonancias

Para analizar los datos de resonancia magnética es nesario obtener la asignación de las resonancias de la proteína, es decir, descubrir qué desplazamiento químico corresponde a cada núcleo atómico. Para lograrlo, se han dearrollado distintos tipos de experimentos, dependiendo de si la proteína está isotópicamente etiquetada o no, pues muchos de los experimentos de asignación dependen del carbono-13 y el nitrógeno-15.

Generación de restricciones

Para realizar cálculos de estructura es necesario generar una serie de parámetros experimentalmente determinados.

Restricciones de distancia

Un "pico de cruce" en un experimento NOESY indica proximidad espacial entre los dos núcleos. Cada pico puede convertirse, por tanto, en una distancia máxima entre los núcleos, normalmente entre 1,8 y 6 angstroms. La intensidad del pico es proporcional a la distancia elevada a -6, de modo que la distancia se determina de acuerdo a la intensidad del pico.

La asignación de picos puede realizarse manualmente, pero resulta mucho más efectivo automatizar esta tarea mediante programas computacionales como CYANA[1]​ y ARIA/CNS.[2]​

Restricciones de ángulos

Las restricciones en los ángulos de torsión de los enlaces químicos, normalmente los ángulos psi y phi pueden generarse de dos modos:

  • Mediante la ecuación Karplus, para generar restricciones angulares a partir de las constantes de acoplamiento
  • Mediante el uso de los desplazamientos químicos.

Ambos métodos utilizan el hecho de que la geometría alrededor del carbono alfa afecta a las constantes de acoplamiento y a los desplazamientos químicos, de modo que dados alguno de estos dos datos, pueden estimarse los ángulos de torsión.

Restricciones de orientación

Las flechas azules representan la orientación del enlace N - H de enlaces peptídicos seleccionados. Mediante la orientación de un número suficiente de enlaces relativos al campo magnético externo, puede determinarse la estructura de la proteína. Tomado de PDB 1KBH.

Las moléculas del analito en una muestra pueden ordenarse parcialmente en relación al campo magnético del espectrómetro mediante la manipulación de las condiciones de la muestra. Las técnicas más comunes incluyen la adición de bacteriófagos o bicelas o la preparación de la muestra en un gel de poliacrilamida. Esto genera un entorno local que favorece ciertas orientaciones de moléculas no esféricas. Normalmente, en la RMN en solución el acoplamiento dipolar entre núcleos se promedia, debido al rápido tumbling de la molécula. El acoplamiento dipolar suele utilizarse en la RMN de estado sólido y proporciona información sobre la orientación relativa de los vectores de enlace en relación a un marco de referencia global. Típicamente, la orientación del vector N-H se determina en un experimento tipo HSQC.[3]​

Intercambio hidrógeno-deuterio

Cálculo de la estructura

Las restricciones determinadas experimentalmente pueden ser utilizadas como input para el proceso de cálculo de la estructura tridimensional. Los programas computacionales, como CYANA o XPLOR-NIH,[4]​ tratan de satisfacer tantas restricciones como sea posible, además de propiedades generales de las proteínas como la longitud de los enlaces y los ángulos. Los algoritmos convierten las restricciones experimentales y las propiedades generales de las proteínas en términos energéticos, y tratan de minimizar la energía. Este proceso resulta en un conjunto de estructuras que convergen si los datos son suficientes para dictar un plegamiento determinado.

Dinámica

La RMN puede ofrecer información sobre la dinámica de varias partes de la proteína, además de sobre la estructura. Esto implica medir tiempos de relajación como T1 y T2 para determinar parámetros de orden, tiempos de correlación y tasas de intercambio químico. La relajación (RMN) es una consecuencia de los campos magnéticos locales que fluctúan en una molécula, generados por movimientos moleculares. De este modo, las medidas de los tiempos de relajación pueden aportar información de los movimientos dentro de una molécula a nivel atómico. En los estudios RMN de dinámica molecular, el isótopo nitrógeno-15 es el núcleo preferido, porque sus tiempos de relajación son relativamente simples para relacionarlos con los movimientos moleculares que, sin embargo, requieren marcar isotópicamente la proteína. Los tiempos de relajación T1 y T2 pueden medirse utilizando varios tipos de experimentos basados en HSQC. Los tipos de movimientos que pueden ser detectados son aquellos que ocurren en una escala de tiempo de entre 10 picosegundos y 10 nanosegundos. Además, pueden estudiarse movimientos más lentos que tienen lugar en un rango temporal de entre 10 microsegundos y 100 milisegundos. No obstante, puesto que los átomos de nitrógeno se encuentran principalmente en el esqueleto de la proteína, los resultados reflejan principalmente los movimientos del esqueleto, que es la parte más rígida de la proteína. Por lo tanto, los resultados obtenidos por la medida de relajación del nitrógeno-15 pueden no ser representativos de la proteína entera. De ahí que, recientemente, se hayan desarrollado técnicas que utilizan medidas de relajación de carbono-13 y deuterio, lo que permite estudios sistemáticos de los movimientos de las cadenas laterales de aminoácidos.

Espectrometría RMN de proteínas grandes

Automatización del proceso

Véase también

Referencias

  1. ↑ Güntert, P. (2004). «Automated NMR structure calculation with CYANA». Methods in molecular biology (en inglés) (Nueva Jersey, Estados Unidos: Humana Press) 278: 353-378. ISSN 1940-6029. OCLC 24839341. PMID 15318003. 
  2. ↑ Rieping, W.; Habeck, M.; et ál. (febrero de 2007). «ARIA2: automated NOE assignment and data integration in NMR structure calculation». Bioinformatics (en inglés) (Oxford, Inglaterra: Oxford University Press) 23 (3): 381-382. ISSN 1367-4811. OCLC 38899833. PMID 17121777. 
  3. ↑ Alba, E. y Tjandra, N. (2004). «Residual dipolar couplings in protein structure determination». Methods in molecular biology (en inglés) (Nueva Jersey, Estados Unidos: Humana Press) 278: 89-106. ISSN 1940-6029. OCLC 24839341. PMID 15317993. 
  4. ↑ Schwieters, C.; Kuszewski, J.; Tjandra, N. y Clore, G. (enero de 2003). «The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package». Journal of magnetic resonance (en inglés) (San Diego, California: Academic Press) 160 (1): 65-73. ISSN 1096-0856. OCLC 35454788. PMID 12565051. 

Bibliografía

Enlaces externos

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