Diferencia entre revisiones de «Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR»

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El Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR o (ARMS-PCR por sus siglas en inglés, Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction) es una técnica para detectar mutaciones puntuales conocidas, descrita por primera vez por el equipo de Newton<ref>{{Cita publicación|url=|título=Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS).|apellidos=Newton, C. R., Graham, A. and Heptinstall, L. E.|nombre=|fecha=1989|publicación=Nucl Acids Res 17, 2503-2516.|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref>. Se ha desarrollado para el diagnóstico de todas las mutaciones β-talasemia comunes que se encuentran en diferentes grupos étnicos alrededor del mundo y sobre todo en los países asiáticos<ref>{{Cita publicación|url=|título=Haemoglobinopathies. Community clues to mutation detection.|apellidos=Old, J. M.|nombre=|fecha=1996|publicación=Methods in Molecular Medicine, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Elles, R. ed), Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 169-183|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref>. La técnica se basa en el principio de cebadores específico de alelo durante el proceso de PCR, es decir, un cebador específico que sólo permite que la amplificación tenga lugar cuando su extremo 3 'terminal de nucleótidos coincide con su secuencia diana. Así, para detectar la mutación β-talasemia IVSI-5 (G-> C), el nucleótido 3 'del cebador de ARMS es G con el fin de par de bases con el C sustituido en el ADN mutante. El cebador forma un desajuste G-G con el ADN normal, pero esto es una falta de coincidencia débil y no prohibir la extensión del cebador por sí mismo. (CC, GA y AA) Sólo se encontraron desajustes fuertes para reducir la eficiencia de cebado a cero o por debajo del 5%, y para evitar la amplificación, una falta de correspondencia aún más con la secuencia diana tuvo que ser introducido en el segundo, tercero o cuarto de nucleótidos de la 3 'del cebador<ref>{{Cita publicación|url=|título=Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type I model studies.|apellidos=Kwok, S., Kellogg, D. E., McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C. and Sninsky, J. J.|nombre=|fecha=1990|publicación=Nucl Acids Res 18, 999-1005.|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref>.
El Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR o (ARMS-PCR por sus siglas en inglés, Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction) es una técnica para detectar mutaciones puntuales conocidas, descrita por primera vez por el equipo de Newton<ref>{{Cita publicación|url=|título=Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS).|apellidos=Newton, C. R., Graham, A. and Heptinstall, L. E.|nombre=|fecha=1989|publicación=Nucl Acids Res 17, 2503-2516.|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref>. Se ha desarrollado para el diagnóstico de todas las mutaciones β-talasemia comunes que se encuentran en diferentes grupos étnicos alrededor del mundo y sobre todo en los países asiáticos<ref>{{Cita publicación|url=|título=Haemoglobinopathies. Community clues to mutation detection.|apellidos=Old, J. M.|nombre=|fecha=1996|publicación=Methods in Molecular Medicine, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Elles, R. ed), Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 169-183|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref>. La técnica se basa en el principio de cebadores específico de alelo durante el proceso de PCR, es decir, un cebador específico que sólo permite que la amplificación tenga lugar cuando su extremo 3 'terminal de nucleótidos coincide con su secuencia diana. Así, para detectar la mutación β-talasemia IVSI-5 (G-> C), el nucleótido 3 'del cebador de ARMS es G con el fin de par de bases con el C sustituido en el ADN mutante. El cebador forma un desajuste G-G con el ADN normal, pero esto es una falta de coincidencia débil y no prohibir la extensión del cebador por sí mismo. (CC, GA y AA) Sólo se encontraron desajustes fuertes para reducir la eficiencia de cebado a cero o por debajo del 5%, y para evitar la amplificación, una falta de correspondencia aún más con la secuencia diana tuvo que ser introducido en el segundo, tercero o cuarto de nucleótidos de la 3 'del cebador<ref>{{Cita publicación|url=|título=Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type I model studies.|apellidos=Kwok, S., Kellogg, D. E., McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C. and Sninsky, J. J.|nombre=|fecha=1990|publicación=Nucl Acids Res 18, 999-1005.|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref>.


== Antecedentes históricos ==
== Antecedentes históricos ==


== Principio ==
== Principio ==
La PCR-ARMS está basada en el mismo principio que ASO, es decir, la utilización de oligonucleótidos específicos para la secuencia normal y para la secuencia mutada. La diferencia estriba en que, en el caso del ARMS, estos oligonucleótidos son cebadores de PCR. Se diseñan, por tanto, dos reacciones de PCR que comparten un mismo cebador común pero se diferencian en los cebadores específicos para cada alelo: un cebador amplificará sólo el alelo normal, el otro cebador amplificará sólo el alelo mutado. Dada la rapidez y sencillez de la PCR, esta técnica está desplazando cada vez más a la técnica de ASO.<ref>{{Cita web|url=http://www.unav.es/ocw/genetica/tema10-2.html|título=Tema 10.2 Métodos de detección de mutaciones.|fechaacceso=21/feb/2016|autor=|enlaceautor=|fecha=|idioma=|sitioweb=|editorial=}}</ref>    
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Como regla general para el diseño de ARMS-PCR, si no coincide terminal 3 'es uno débil, un fuerte desajuste secundaria está diseñado. Si es muy fuerte, se introduce una falta de coincidencia secundaria débil. Trate de poner la falta de coincidencia en el segundo nucleótido en la primera instancia y probar la cartilla de la especificidad y la generación de producto. La posición de la desigualdad puede ser alterado si el primario no funciona, o la fuerza de la falta de coincidencia aumenta si se observan bandas no específicas. Según pequeño en Current Protocols in Human Genetics (28), la fuerza de emparejamientos son desajuste; máxima, GA, CT, TT; fuerte, CC; medio, AA, GG; Débil, CA, GT; ninguno, AT, GC.


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Como regla general para el diseño de ARMS-PCR, si no coincide terminal 3 'es uno débil, un fuerte desajuste secundaria está diseñado. Si es muy fuerte, se introduce una falta de coincidencia secundaria débil. Trate de poner la falta de coincidencia en el segundo nucleótido en la primera instancia y probar la cartilla de la especificidad y la generación de producto. La posición de la desigualdad puede ser alterado si el primario no funciona, o la fuerza de la falta de coincidencia aumenta si se observan bandas no específicas. Según pequeño en Current Protocols in Human Genetics<ref>{{Cita publicación|url=|título=Amplification-Refractory Mutation System (ARMS) analysis of point mutations.|apellidos=Little S.|nombre=|fecha=1994|publicación=Current Protocols in Human Molecular Genetics. (Eds. Nicholas C Dracopoli et al.), John Wiley & Sons, Inc. New York, pp9.8.1. – 9.8.12.|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref>, la fuerza de emparejamientos son desajuste; máxima, GA, CT, TT; fuerte, CC; medio, AA, GG; Débil, CA, GT; ninguno, AT, GC.<ref name=":6">{{Cita web|url=http://www.ithanet.eu/ithapedia/index.php/Protocol:Amplification_refractory_mutation_system_(ARMS)|título=Protocol: Amplification Refractory Mutation System (ARMS)|fechaacceso=20/feb/2016|autor=|enlaceautor=|fecha=|idioma=|sitioweb=|editorial=}}</ref>
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Los brazos cebadores de mutación específica utilizados en el laboratorio de Oxford para el diagnóstico de las 25 mutaciones β-talasemia más comunes, además de la variantes de la hemoglobina HbS, HbC y HbE, se enumeran en la Tabla 3. Todos son 30 bases de longitud, para que puedan ser usados a una sola temperatura de recocido a alta (65 oC).


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Los cebadores de mutación específica utilizados en el laboratorio de Oxford para el diagnóstico de las 25 mutaciones β-talasemia más comunes, además de la variantes de la hemoglobina HbS, HbC y HbE, se enumeran en la Tabla 3. Todos son 30 bases de longitud, para que puedan ser usados a una sola temperatura de recocido a alta (65 oC).<ref name=":6" />
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Una prueba de ARMS típico para una sola mutación se compone de dos amplificaciones de la misma mezcla de reacción utilizando el mismo ADN genómico como sustrato. Uno Resultados de productos de amplificación a partir del cebador ARMS específica y su par de cebadores (cuando la mutación está presente en el ADN genómico) y los otros resultados de la amplificación de dos cebadores que generan un fragmento de control en todos los casos. La generación de producto de control indica la mezcla de reacción y ciclador térmico está funcionando de manera óptima. Figura 5.7 muestra la proyección de una muestra de ADN para una mutación β-talasemia. La estrategia consiste en la detección de las mutaciones comunes esperados en el país del origen étnico del paciente en primer lugar y luego para la detección de las mutaciones más raras. Después de lo cual, las mutaciones no caracterizados son identificados por secuenciación genómica.


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Una prueba de ARMS típica para una sola mutación se compone de dos amplificaciones de la misma mezcla de reacción utilizando el mismo ADN genómico como sustrato. Uno Resultados de productos de amplificación a partir del cebador ARMS específica y su par de cebadores (cuando la mutación está presente en el ADN genómico) y los otros resultados de la amplificación de dos cebadores que generan un fragmento de control en todos los casos. La generación de producto de control indica la mezcla de reacción y ciclador térmico está funcionando de manera óptima. Figura 5.7 muestra la proyección de una muestra de ADN para una mutación β-talasemia. La estrategia consiste en la detección de las mutaciones comunes esperados en el país del origen étnico del paciente en primer lugar y luego para la detección de las mutaciones más raras. Después de lo cual, las mutaciones no caracterizados son identificados por secuenciación genómica.<ref name=":6" />
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Los cebadores para el diagnóstico de los alelos normales para muchas de estas mutaciones se enumeran en la Tabla 5.5. Estos son necesarios cuando ambas partes de un par solicitar el diagnóstico prenatal de la β-talasemia llevan la misma mutación. Un ejemplo de diagnóstico prenatal utilizando mutantes y normales ARMAS cebadores se muestra en la Figura 5.8.

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Los cebadores para el diagnóstico de los alelos normales para muchas de estas mutaciones se enumeran en la Tabla 5.5. Estos son necesarios cuando ambas partes de un par solicitar el diagnóstico prenatal de la β-talasemia llevan la misma mutación. Un ejemplo de diagnóstico prenatal utilizando mutantes y normales ARMAS cebadores se muestra en diferentes figuras.<ref name=":6" />

Dicho de otra forma, una PCR ARMS estándar consiste en dos reacciones complementarias (dos tubos) y utiliza 3 cebadores. Un cebador es constante y complementarios a la plantilla en ambas reacciones, los otros cebadores difieren en sus extremos 3 residuos terminales 'y son específicos para o bien la secuencia de ADN de tipo salvaje o la secuencia mutada en una base dada sólo uno de estos cebadores se utiliza por tubo. productos de PCR se separaron por electroforesis a través de un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio. Si la muestra es homocigótico amplificación de tipo salvaje o mutante homocigótico sólo se producirá sólo en uno de los tubos, si la muestra es la amplificación heterocigotos se verá en ambos tubos.<ref name=":7">{{Cita web|url=http://cf.eqascheme.org/info/public/cf/assayarms.xhtml|título=Amplification Refractory Mutation System (ARMS)|fechaacceso=21/feb/2016|autor=|enlaceautor=|fecha=|idioma=|sitioweb=|editorial=}}</ref>    

ARMS es un método basado en PCR, que utiliza de cebado específico de alelo. En este método, un cebador de oligonucleótido con un extremo de triple complementaria a la secuencia de una mutación específica, junto con un cebador común se utiliza en una reacción de PCR. En paralelo, un cebador normal correspondiente, junto con un cebador común se utiliza en otra reacción PCR. La presencia de un producto amplificado en la primera reacción indica la presencia de la mutación mientras que su ausencia indica la presencia de la secuencia de ADN normal en ese sitio específico. En la segunda reacción, la presencia de un producto amplificado indica la presencia de una secuencia de ADN normal en ese sitio específico, mientras que su ausencia indica presencia de la mutation<ref name=":8">{{Cita publicación|url=|título=AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM (ARMS) AND REVERSE HYBRIDIZATION IN THE DETECTION OF BETA-THALASSEMIA MUTATIONS|apellidos=Hossein Najmabadi, Shahram Teimourian, Talayeh Khatibi,
Maryam Neishabury, Farzin Pourfarzad, Sayeh Jalil-Nejad, Maryam Azad, Christian Oberkanins, Walter Krugluger|nombre=|fecha=2001|publicación=Arch Irn Med; 4 (4): 165-170|fechaacceso=|doi=|pmid=}}</ref>.

La Figura 1 muestra ARMS-PCR a su vez en un gel de agarosa al 2%. La presencia de un mutante amplificado los ARMS producto cebador indica la presencia del alelo mutante. Todas las muestras contienen una banda de control interno. Muestra 1 contiene un producto amplificado en el cebador normal, pero carece de ella en el cebador mutante; por lo tanto, lo que implica un individuo normal. Muestra 2 contiene un producto amplificado en ambos los cebadores normales y mutantes; asignar el individuo de tipo menor. Muestra 3 contiene un producto amplificado sólo en el cebador mutante; por lo tanto, es la muestra de un individuo que es de tipo principal.<ref name=":8" />    


== Método ==
== Método ==
Un total de 8 a 10 especímenes de muestras de sangre EDTA, amniótico muestra de vellosidades coriónicas o fluido (CVS) se obtuvieron de seleccionados al azar menor beta-talasemia diagnosticada clínicamente y los principales pacientes. Se extrajo el ADN de las muestras usando con el fin de llevar a cabo ARMS, se extrajo primero el ADN de interés. Después de la extracción del ADN, las reacciones de PCR se establecieron en dos tubos separados para cada muestra. Un tubo de ensayo para la amplificación del cebador de ARMS normal y el segundo para la amplificación del cebador de ARMS mutante. Los cebadores utilizados para las armas fueron amablemente proporcionados por JM Old.<ref name=":8" />

El método propuesto para preparar y realizar un Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR es el siguiente:

1 Preparar una mezcla de reacción (4 ml) que comprende de: 0,5 ml de 10x tampón de PCR ARMS; 1,25 ml de 1,35 mezcla dNTP mM; 2,65 ml de agua destilada estéril
1 Preparar una mezcla de reacción (4 ml) que comprende de: 0,5 ml de 10x tampón de PCR ARMS; 1,25 ml de 1,35 mezcla dNTP mM; 2,65 ml de agua destilada estéril


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== Materiales ==
== Materiales ==
'''dNTP'''
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1 dNTPs: Sume 50 l de una solución 100 mM de cada dNTP (comprado) y 3,8 ml de agua destilada. El dNTP solución madre 1,25 mM se debe almacenar en alícuotas congeladas.


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Sume 50 l de una solución 100 mM de cada dNTP (comprado) y 3,8 ml de agua destilada. El dNTP solución madre 1,25 mM se debe almacenar en alícuotas congeladas.<ref name=":6" />
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2 brazos tampón de PCR: 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), MgCl2 1,5 mM, 100 mg / ml de gelatina. Un tampón 10x de valores puede ser preparado mediante la suma de 0,5 ml de 1 M Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), 1,25 ml de 2 M KCl, 75 l de 1 M de MgCl2, 5 mg de gelatina, y 3.275 ml de agua destilada . La reserva de estabilización se calienta a 37 0C hasta que se disuelve la gelatina y luego se congeló en alícuotas.


'''Cebadores'''
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3 Taq polimerasas: los sugeridos son los siguientes, AmpliTaq Gold (PE Biosystems) que funciona mejor para pruebas de digestión ARMS-PCR / RE y Platinum Taq (Gibco Life Technologies) para Gap-PCR (ver Métodos). (EDTA Tris-borato (TBE) tampón: 89 mM Tris-borato, 89 mM ácido bórico, 10 mM EDTA pH 8,0).

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50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), MgCl2 1,5 mM, 100 mg / ml de gelatina. Un tampón 10x de valores puede ser preparado mediante la suma de 0,5 ml de 1 M Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), 1,25 ml de 2 M KCl, 75 l de 1 M de MgCl2, 5 mg de gelatina, y 3.275 ml de agua destilada . La reserva de estabilización se calienta a 37 0C hasta que se disuelve la gelatina y luego se congeló en alícuotas.<ref name=":6" />

'''Taq polimerasas'''

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los sugeridos son los siguientes, AmpliTaq Gold (PE Biosystems) que funciona mejor para pruebas de digestión ARMS-PCR / RE y Platinum Taq (Gibco Life Technologies) para Gap-PCR. (EDTA Tris-borato (TBE) tampón: 89 mM Tris-borato, 89 mM ácido bórico, 10 mM EDTA pH 8,0).<ref name=":6" />

== Condiciones ==
Se utilizó un total de 20 l de volumen final de reacción de PCR para este propósito. El volumen de reacción se compone de 0,5 microgramos de la plantilla de ADN, 0,01 g de cada uno de los cuatro cebadores (2 cebadores de control, 1 cebador común, y 1 mutante / ARMS normales cebador para la reacción normal / mutante), 0,5 unidad de Taq ADN polimerasa , y 0,2 mM de cada dNTP en una solución de tris-C1 10 mM, MgCl2 50 mM y espermidina 1 mM. El régimen de ciclo térmico consistió en 30 ciclos de: precalentamiento a 94 ̊ C durante 2 minutos, desnaturalización a 94 ̊ C durante 1 minuto, hibridación variables, y extensión a 72 ̊ C durante 1 minuto.<ref name=":8" />


== Optimizaciones ==
== Optimizaciones ==
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Para evaluar los errores resultantes de la utilización de electroforegramas multibanda para distinguir amplicones, la longitud de lectura de cada banda se comparó con las longitudes teóricos calculados a partir de imprimación-alineación (Tabla 2). No se observó superposición en el rango de longitud de lectura entre dos cualesquiera de los amplicones, adicionalmente aliado, no hay superposición de los intervalos de confianza del 99% de la longitud de lectura promedio observado. Es notable que la intensidad de la banda pueden ser objeto de varios factores, incluyendo la calidad del ADN genómico y PCR calidad de los reactivos; se ha encontrado que 50 a 100 ng / ml de ADN es óptima para proporcionar bandas suficientemente clara y brillante con el fondo mínima (datos no mostrados). Además, a diferencia de la mayoría de otros métodos informó T-ARMS-PCR, una falta de coincidencia deliberado en la posición -1 de la 39 terminal se incorporó en ambos cebadores internos y era suficientemente específico para la detección diferencial de dos alelos para cada SNP. Debido a la limitación de tamaño de la discriminación entre los productos de PCR, diseño de cebadores de PCR puede ser restringido en cierta medida, hacer múltiples T-ARMS-PCR difícil de escribir los SNPs que se encuentran más cerca que 20 pb de la otra.
Para evaluar los errores resultantes de la utilización de electroforegramas multibanda para distinguir amplicones, la longitud de lectura de cada banda se comparó con las longitudes teóricos calculados a partir de imprimación-alineación (Tabla 2). No se observó superposición en el rango de longitud de lectura entre dos cualesquiera de los amplicones, adicionalmente aliado, no hay superposición de los intervalos de confianza del 99% de la longitud de lectura promedio observado. Es notable que la intensidad de la banda pueden ser objeto de varios factores, incluyendo la calidad del ADN genómico y PCR calidad de los reactivos; se ha encontrado que 50 a 100 ng / ml de ADN es óptima para proporcionar bandas suficientemente clara y brillante con el fondo mínima (datos no mostrados). Además, a diferencia de la mayoría de otros métodos informó T-ARMS-PCR, una falta de coincidencia deliberado en la posición -1 de la 39 terminal se incorporó en ambos cebadores internos y era suficientemente específico para la detección diferencial de dos alelos para cada SNP. Debido a la limitación de tamaño de la discriminación entre los productos de PCR, diseño de cebadores de PCR puede ser restringido en cierta medida, hacer múltiples T-ARMS-PCR difícil de escribir los SNPs que se encuentran más cerca que 20 pb de la otra.


Dos claras ventajas del método ARMS-PCR múltiple son el corto tiempo de ensayo y los bajos costos, incluso para ensayar un gran número de muestras. El método propuesto, solo que incluya la PCR convencional con un CE, puede llevarse a cabo antes de 3,5 horas con un mínimo esfuerzo práctico. Después de la extracción de ADN genómico, los pasos posteriores se pueden completar en un solo tubo de reacción, lo que permite el análisis de múltiples muestras listo en una única prueba para cribado de alto rendimiento. Este ensayo consume solamente reactivos de PCR estándar y cartuchos de electroforesis; los costos en este estudio fueron sólo 2 US $ para la detección simultánea de seis SNPs por muestra. Para nuestro conocimiento, el método propuesto es el primero en detectar seis SNPs en una única reacción usando tetra-primer ARMS-PCR. El nuevo método multiplex tetra-primer ARMS-PCR desarrollada en este estudio tiene un potencial significativo para ser ampliamente aplicable tanto en entornos comerciales y clínicas para la detección de múltiples SNPs.<ref name=":0" />   
Dos claras ventajas del método ARMS-PCR múltiple son el corto tiempo de ensayo y los bajos costos, incluso para ensayar un gran número de muestras. El método propuesto, solo que incluya la PCR convencional con un CE, puede llevarse a cabo antes de 3,5 horas con un mínimo esfuerzo práctico. Después de la extracción de ADN genómico, los pasos posteriores se pueden completar en un solo tubo de reacción, lo que permite el análisis de múltiples muestras listo en una única prueba para cribado de alto rendimiento. Este ensayo consume solamente reactivos de PCR estándar y cartuchos de electroforesis; los costos en este estudio fueron sólo 2 US $ para la detección simultánea de seis SNPs por muestra. Para nuestro conocimiento, el método propuesto es el primero en detectar seis SNPs en una única reacción usando tetra-primer ARMS-PCR. El nuevo método multiplex tetra-primer ARMS-PCR desarrollada en este estudio tiene un potencial significativo para ser ampliamente aplicable tanto en entornos comerciales y clínicas para la detección de múltiples SNPs.<ref name=":0" />

El polimorfismo de nucleótido único (SNP) genotipificación se considera actualmente como una herramienta particularmente valiosa para el diagnóstico de diferentes patologías. Por esta razón, en los últimos años una gran cantidad de esfuerzo se ha dedicado al desarrollo de tecnologías precisas, rápidas y rentables para el análisis de SNP. A pesar de que un gran número de enfoques distintos se ha informado cada laboratorio utilice uno de los métodos publicados en función de su capacidad técnica y económica. En este artículo se presenta una aplicación de un ensayo en el local, BRAZOS tetra-primer ensayo de PCR, y su aplicación en la genotipificación de SNP. Hemos demostrado que este ensayo podría ser más ventajoso en comparación con la PCR-RFLP, PCR en tiempo real, y la secuenciación del ADN. Hemos demostrado que el ensayo tiene éxito en el genotipado usando tejidos embebidos en parafina archivados, muestras heparinated y líquido amniótico con meconio. Estos ensayos de baja presupuestado (3 $ / reacción) podrían completarse tras 3-4 horas después de la recepción de muestras que permite un tiempo razonable vuelco en el laboratorio. Desde BRAZOS tetra-primer ensayo de PCR no requiere ningún equipo especial, el ensayo se podría establecer en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico clínico.<ref>{{Cita publicación|url=|título=Development and validation of a cost-effective in-house method, tetra-primer ARMS PCR assay, in genotyping of seven clinically important point mutations|apellidos=Ozdal Etlik, Vedat Koksal, S. Tugba Arican-Baris, Ibrahim Baris|nombre=|fecha=2011|publicación=Molecular and Cellular Probes Volume 25, Issue 4, August 2011, Pages 177–181|fechaacceso=|doi=10.1016/j.mcp.2011.04.005|pmid=}}</ref>

== Aplicaciones ==

=== PCR-ARMS e hibridación reversa en la detección de mutaciones en beta-thalassemia ===
Antecedentes: beta-talasemia es la enfermedad hereditaria más común en Irán y durante los últimos 10 años, el sistema de amplificación refractario a las mutaciones (ARMS) y el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) fueron la única técnica molecular utilizada para el diagnóstico de la enfermedad. Aunque existen muchas mutaciones del gen beta-globina en la población multiétnica de Irán, estas técnicas parecen mucho trabajo, mucho tiempo y es caro. Esto nos ha instado a utilizar nuevas técnicas como la hibridación inversa y secuenciación directa de este problema.<ref name=":8" />

Métodos: En este estudio, hibridación inversa en paralelo con los brazos para la detección de las 10 mutaciones beta-talasemia más comunes y la hemoglobina S en 82 pacientes con diagnóstico clínico de menor importancia beta-talasemia y la mayor.<ref name=":8" />

A partir de los resultados, 82 casos detectables por ambos métodos, 80 tuvieron resultados similares. En comparación a las armas, la hibridación inversa parece ser más fiable, rentable, rápido y aplicable.<ref name=":8" />

Conclusión: teniendo en cuenta el amplio espectro de mutaciones beta-talasemia en Irán, una técnica rápida y fiable, como hibridación inversa representa ventajas vitales en comparación con los métodos de diagnóstico tradicionales. De hecho, se recomienda como la técnica de elección que puede ser empleada por el Proyecto Nacional de Talasemia para la detección y el diagnóstico prenatal de la talasemia beta en Irán.<ref name=":8" />    

=== Identificación de SNPs comparando PCR-ARMS con PCR-RFLP ===
La identificación de polimorfismos de nucleótido único (SNP) es ahora posible mediante muchas técnicas, pero la elección de uno de estos métodos para un caso particular representa todo un reto, debido a que el investigador debe tener en cuenta muchos factores.<ref name=":9">{{Cita web|url=https://www.researchgate.net/publication/214419667_A_comparative_study_of_ARMS_-_PCR_and_RFLP_-_PCR_as_methods_for_rapid_SNP_identification|título=A comparative study of ARMS - PCR and RFLP - PCR as methods for rapid SNP identification|fechaacceso=18/feb/2016|autor=|enlaceautor=|fecha=|idioma=|sitioweb=|editorial=}}</ref>

En este artículo los autores están tratando de presentar un estudio comparativo de dos métodos, que se utiliza actualmente en nuestro laboratorio, para la identificación de polimorfismos SNP: ARMS - PCR (sistema de mutación refractaria amplificación) y RFLP - PCR (restricción polimorfismo de longitud de fragmentos). Los dos SNPs en el que nos centramos pertenecen al gen VDR humano (gen del receptor de la vitamina D) y son ApaI (un cambio de base G → T en el intrón 8) y Taq I (T → cambio de base C silenciosa en el codón 352), el nombre de la enzimas de restricción que reconocen estas variaciones. <ref name=":9" />

Dado que los resultados obtenidos por los dos métodos se confirmaron por secuenciación directa, concluimos que el método ARMS-PCR es el más adecuado para la detección de los genotipos alternativos determinados por mutaciones de una sola base. La simplicidad de este método lo hace adecuado para el análisis de gran número de muestras, situación que por lo general se cumple en casos y controles y estudios genéticos de población, porque esta prueba es fácil de usar, costo - efectiva y tener una precisión de 99,9% .<ref name=":9" />

=== Biopsias clínicas ===
Se han comparado el análisis de mutación mediante secuenciación de ADN y amplificación refractaria mutación System ™ (ARMS ™) por su capacidad para detectar mutaciones en muestras de biopsia clínicos. Se han evaluado cinco en tiempo real ARMAS ensayos: BRAF 1799T> A, [esto incluye V600E y V600K] y las ANR 182A> G [Q61R] y 181c> A [Q61K] en el melanoma, el EGFR 2573T> G [L858R], 2235- 2249del15 [E746-A750del] en el cáncer de pulmón no de células pequeñas, y compararon los resultados con la secuenciación del ADN de la mutación 'puntos calientes' de estos genes en el tumor incluido en parafina y fijado en formalina ADN (FF-PET). Los ensayos ARMS maximizan el número de muestras que podrían analizarse cuando tanto la calidad y cantidad de ADN fue baja, y mejoraron tanto la sensibilidad y la velocidad de análisis en comparación con la secuenciación. Armas fue más robusta con menos fallos de reacción en comparación con la secuencia y fue más sensible, ya que fue capaz de detectar mutaciones funcionales que no fueron detectados por secuenciación del ADN. La secuenciación del ADN fue capaz de detectar un pequeño número de baja frecuencia mutaciones recurrentes a través de los exones seleccionados que no fueron interrogados usando los ensayos ARMS específicos en estos estudios. La PCR-ARMS fue más sensible y robusto en la detección de mutaciones somáticas definidos que la secuenciación de ADN en muestras clínicas en las que el tipo de muestra predominante fue FF-PET.<ref>{{Cita publicación|url=|título=A comparison of ARMS and DNA sequencing for mutation analysis in clinical biopsy samples|apellidos=Gillian EllisonEmail author
, Emma Donald, Gael McWalter, Lucy Knight, Lynn Fletcher, James Sherwood, Mireille Cantarini, Maria Orr and Georgina Speake|nombre=|fecha=2010|publicación=Journal of Experimental & Clinical Cancer Research; Ellison et al; licensee BioMed Central Ltd. 2010|fechaacceso=|doi=10.1186/1756-9966-29-132|pmid=}}</ref>    

== Ventajas ==
Rápido, fiable y no isotópico. multiplexación solo tubo es posible con los ARMAS fluorescentes más recientes.<ref name=":7" />

== Desventajas ==
El formato original no distinguía entre homocigotos y heterocigotos, excepto por la mutación F508del. Sin embargo, BRAZOS fluorescentes pueden distinguir entre los homocigotos y heterocigotos.<ref name=":7" />

== Kits Comerciales ==
CF29v2, CF30, CF-polyT = ARMS múltiple (4 tubos, el número de cebadores en una única reacción); CF4v2 y CF-EU2 = ARMS fluorescentes múltiple (1 metro). Los dos ejemplos son kits que comercializa Gen-Probe Life Sciences.<ref name=":7" />


== Referencias ==
== Referencias ==

Revisión del 17:41 26 feb 2016

El Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR o (ARMS-PCR por sus siglas en inglés, Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction) es una técnica para detectar mutaciones puntuales conocidas, descrita por primera vez por el equipo de Newton[1]​. Se ha desarrollado para el diagnóstico de todas las mutaciones β-talasemia comunes que se encuentran en diferentes grupos étnicos alrededor del mundo y sobre todo en los países asiáticos[2]​. La técnica se basa en el principio de cebadores específico de alelo durante el proceso de PCR, es decir, un cebador específico que sólo permite que la amplificación tenga lugar cuando su extremo 3 'terminal de nucleótidos coincide con su secuencia diana. Así, para detectar la mutación β-talasemia IVSI-5 (G-> C), el nucleótido 3 'del cebador de ARMS es G con el fin de par de bases con el C sustituido en el ADN mutante. El cebador forma un desajuste G-G con el ADN normal, pero esto es una falta de coincidencia débil y no prohibir la extensión del cebador por sí mismo. (CC, GA y AA) Sólo se encontraron desajustes fuertes para reducir la eficiencia de cebado a cero o por debajo del 5%, y para evitar la amplificación, una falta de correspondencia aún más con la secuencia diana tuvo que ser introducido en el segundo, tercero o cuarto de nucleótidos de la 3 'del cebador[3]​.

Antecedentes históricos

Principio

La PCR-ARMS está basada en el mismo principio que ASO, es decir, la utilización de oligonucleótidos específicos para la secuencia normal y para la secuencia mutada. La diferencia estriba en que, en el caso del ARMS, estos oligonucleótidos son cebadores de PCR. Se diseñan, por tanto, dos reacciones de PCR que comparten un mismo cebador común pero se diferencian en los cebadores específicos para cada alelo: un cebador amplificará sólo el alelo normal, el otro cebador amplificará sólo el alelo mutado. Dada la rapidez y sencillez de la PCR, esta técnica está desplazando cada vez más a la técnica de ASO.[4]​    

Como regla general para el diseño de ARMS-PCR, si no coincide terminal 3 'es uno débil, un fuerte desajuste secundaria está diseñado. Si es muy fuerte, se introduce una falta de coincidencia secundaria débil. Trate de poner la falta de coincidencia en el segundo nucleótido en la primera instancia y probar la cartilla de la especificidad y la generación de producto. La posición de la desigualdad puede ser alterado si el primario no funciona, o la fuerza de la falta de coincidencia aumenta si se observan bandas no específicas. Según pequeño en Current Protocols in Human Genetics[5]​, la fuerza de emparejamientos son desajuste; máxima, GA, CT, TT; fuerte, CC; medio, AA, GG; Débil, CA, GT; ninguno, AT, GC.[6]​

Los cebadores de mutación específica utilizados en el laboratorio de Oxford para el diagnóstico de las 25 mutaciones β-talasemia más comunes, además de la variantes de la hemoglobina HbS, HbC y HbE, se enumeran en la Tabla 3. Todos son 30 bases de longitud, para que puedan ser usados a una sola temperatura de recocido a alta (65 oC).[6]​

Una prueba de ARMS típica para una sola mutación se compone de dos amplificaciones de la misma mezcla de reacción utilizando el mismo ADN genómico como sustrato. Uno Resultados de productos de amplificación a partir del cebador ARMS específica y su par de cebadores (cuando la mutación está presente en el ADN genómico) y los otros resultados de la amplificación de dos cebadores que generan un fragmento de control en todos los casos. La generación de producto de control indica la mezcla de reacción y ciclador térmico está funcionando de manera óptima. Figura 5.7 muestra la proyección de una muestra de ADN para una mutación β-talasemia. La estrategia consiste en la detección de las mutaciones comunes esperados en el país del origen étnico del paciente en primer lugar y luego para la detección de las mutaciones más raras. Después de lo cual, las mutaciones no caracterizados son identificados por secuenciación genómica.[6]​

Los cebadores para el diagnóstico de los alelos normales para muchas de estas mutaciones se enumeran en la Tabla 5.5. Estos son necesarios cuando ambas partes de un par solicitar el diagnóstico prenatal de la β-talasemia llevan la misma mutación. Un ejemplo de diagnóstico prenatal utilizando mutantes y normales ARMAS cebadores se muestra en diferentes figuras.[6]​

Dicho de otra forma, una PCR ARMS estándar consiste en dos reacciones complementarias (dos tubos) y utiliza 3 cebadores. Un cebador es constante y complementarios a la plantilla en ambas reacciones, los otros cebadores difieren en sus extremos 3 residuos terminales 'y son específicos para o bien la secuencia de ADN de tipo salvaje o la secuencia mutada en una base dada sólo uno de estos cebadores se utiliza por tubo. productos de PCR se separaron por electroforesis a través de un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio. Si la muestra es homocigótico amplificación de tipo salvaje o mutante homocigótico sólo se producirá sólo en uno de los tubos, si la muestra es la amplificación heterocigotos se verá en ambos tubos.[7]​    

ARMS es un método basado en PCR, que utiliza de cebado específico de alelo. En este método, un cebador de oligonucleótido con un extremo de triple complementaria a la secuencia de una mutación específica, junto con un cebador común se utiliza en una reacción de PCR. En paralelo, un cebador normal correspondiente, junto con un cebador común se utiliza en otra reacción PCR. La presencia de un producto amplificado en la primera reacción indica la presencia de la mutación mientras que su ausencia indica la presencia de la secuencia de ADN normal en ese sitio específico. En la segunda reacción, la presencia de un producto amplificado indica la presencia de una secuencia de ADN normal en ese sitio específico, mientras que su ausencia indica presencia de la mutation[8]​.

La Figura 1 muestra ARMS-PCR a su vez en un gel de agarosa al 2%. La presencia de un mutante amplificado los ARMS producto cebador indica la presencia del alelo mutante. Todas las muestras contienen una banda de control interno. Muestra 1 contiene un producto amplificado en el cebador normal, pero carece de ella en el cebador mutante; por lo tanto, lo que implica un individuo normal. Muestra 2 contiene un producto amplificado en ambos los cebadores normales y mutantes; asignar el individuo de tipo menor. Muestra 3 contiene un producto amplificado sólo en el cebador mutante; por lo tanto, es la muestra de un individuo que es de tipo principal.[8]​    

Método

Un total de 8 a 10 especímenes de muestras de sangre EDTA, amniótico muestra de vellosidades coriónicas o fluido (CVS) se obtuvieron de seleccionados al azar menor beta-talasemia diagnosticada clínicamente y los principales pacientes. Se extrajo el ADN de las muestras usando con el fin de llevar a cabo ARMS, se extrajo primero el ADN de interés. Después de la extracción del ADN, las reacciones de PCR se establecieron en dos tubos separados para cada muestra. Un tubo de ensayo para la amplificación del cebador de ARMS normal y el segundo para la amplificación del cebador de ARMS mutante. Los cebadores utilizados para las armas fueron amablemente proporcionados por JM Old.[8]​

El método propuesto para preparar y realizar un Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR es el siguiente:

1 Preparar una mezcla de reacción (4 ml) que comprende de: 0,5 ml de 10x tampón de PCR ARMS; 1,25 ml de 1,35 mezcla dNTP mM; 2,65 ml de agua destilada estéril

2 de pipeta 20 l de mezcla de reacción PCR en un tubo de 0.5 mL.

3 Añadir 1 l de cada cebador (1 unidad de DO / ml).

4 Añadir 0,05 l de Taq ADN polimerasa (5U / l).

5 Cuando se realiza más de una prueba, un cebador y la enzima se pueden mezclar juntos en un tubo separado antes de la adición a la mezcla de reacción. Esto disminuye los errores de pipeteado como se utilizan grandes cantidades.

6 Añadir 1 l de ADN genómico (100 ng / l).

7 superposición con 25 l de aceite mineral.

8 Mix, centrífuga y el lugar en el termociclador.

9 Amplify durante 25 ciclos como sigue: 1 min a 94 oC / 1 min a 65 oC / 1,5 min a 72 oC con un periodo de extensión final de 3 minutos a 72 oC después del ciclo de 25a.

10 Retire los tubos de termociclador y añadir 5 l de colorante azul. Mezclar y centrifugar.

11 Cargar una alícuota de 20 l en un gel de agarosa al 3% y correr a 100 V durante aprox. 45 min en TBE

12 de la mancha de gel en una solución de bromuro de etidio (0,5 mg / ml) durante 15-30 minutos, visualizar bandas en una caja de luz UV (312 nm) y fotografiar con un sistema de cámara electrónica o una cámara Polaroid CU-5 equipado con un filtro naranja ( por ejemplo Wratten 22A).

Materiales

dNTP

Sume 50 l de una solución 100 mM de cada dNTP (comprado) y 3,8 ml de agua destilada. El dNTP solución madre 1,25 mM se debe almacenar en alícuotas congeladas.[6]​

Cebadores

50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), MgCl2 1,5 mM, 100 mg / ml de gelatina. Un tampón 10x de valores puede ser preparado mediante la suma de 0,5 ml de 1 M Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), 1,25 ml de 2 M KCl, 75 l de 1 M de MgCl2, 5 mg de gelatina, y 3.275 ml de agua destilada . La reserva de estabilización se calienta a 37 0C hasta que se disuelve la gelatina y luego se congeló en alícuotas.[6]​

Taq polimerasas

los sugeridos son los siguientes, AmpliTaq Gold (PE Biosystems) que funciona mejor para pruebas de digestión ARMS-PCR / RE y Platinum Taq (Gibco Life Technologies) para Gap-PCR. (EDTA Tris-borato (TBE) tampón: 89 mM Tris-borato, 89 mM ácido bórico, 10 mM EDTA pH 8,0).[6]​

Condiciones

Se utilizó un total de 20 l de volumen final de reacción de PCR para este propósito. El volumen de reacción se compone de 0,5 microgramos de la plantilla de ADN, 0,01 g de cada uno de los cuatro cebadores (2 cebadores de control, 1 cebador común, y 1 mutante / ARMS normales cebador para la reacción normal / mutante), 0,5 unidad de Taq ADN polimerasa , y 0,2 mM de cada dNTP en una solución de tris-C1 10 mM, MgCl2 50 mM y espermidina 1 mM. El régimen de ciclo térmico consistió en 30 ciclos de: precalentamiento a 94 ̊ C durante 2 minutos, desnaturalización a 94 ̊ C durante 1 minuto, hibridación variables, y extensión a 72 ̊ C durante 1 minuto.[8]​

Optimizaciones

Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR con Tetra-Cebadores (T-ARMS-PCR)

El sistema de mutación refractario a la amplificación por PCR con tetra-cebadores (T-ARMS-PCR) es un medio rápido y económico para el ensayo de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), requiriendo sólo la amplificación por PCR y la posterior electroforesis para la determinación de genotipos. Para mejorar el rendimiento y la eficiencia de la T-ARMS-PCR, se puede combinar la T-ARMS-PCR con una estrategia quimérica de interrupción de temperatura basada en los iniciadores o cebadores de PCR (TSP) y asimismo se puede utilizar la electroforesis capilar (CE) para la separación e identificación de los resultados de la amplificación, los amplicones. En el 2013, algunos investigadores evaluaron este proceso en el genotipado simultáneo de cuatro tipos de cáncer de mama y dos relacionados con el riesgo de cáncer de cuello uterino, todos relacionados con algunos SNPs[9]​.

Un total de 24 cebadores T-ARMS-PCR, cada uno etiquetado con una secuencia universal en el extremo 5’ y un par de cebadores universales, fueron agrupados para amplificar los 12 alelos de 6 SNPs en 186 muestras de sangre de mujeres que fungirían como controles. También se realizó una secuenciación directa de todas las muestras para evaluar la exactitud de este método.[9]​

De las 186 muestras se pudieron producir hasta 11 amplicones en una sola PCR y ser separados por Electroforesis Capilar. Los resultados de genotipado con la T-ARMS-PCR múltiple estaban en completa concordancia con la secuenciación directa de todas las muestras. Este nuevo método de T-ARMS-PCR múltiple es el primer método reportado que permite determinar el genotipo de seis SNPs en una sola reacción sin ningún tratamiento post-PCR distinta de la electrophoresis; este método es fiable, rápido y fácil de realizar.[9]​

El papel de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) es el de contribuir a la variabilidad entre individuos, aveces haciéndolos susceptibles al cáncer[10]​, el crecimiento del tumor y la tasa de metástasis[11]​[12]​[13]​, así como en la eficacia del tratamiento y las respuestas adversas a los medicamentos[14]​[15]​. Entre los muchos métodos que se han desarrollado para determinar el genotipo de los SNPs; el sistema de mutación refractario a la amplificación por PCR con tetra-cebadores (T-ARMS-PCR) ha demostrado ser rápido, simple y económico[16]​[17]​[18]​[19]​[20]​. A través de la combinación de dos cebadores externos y los dos cebadores internos específicos para algún alelo, la genotipificación requiere sólo una PCR seguida de una separación por electroforesis[17]​. La incorporación de una T-Arms- PCR múltiple, con ocho cebadores en una PCR hace capaz la detección de manera simultánea de dos mutaciones[20]​.

Por separado, a base de imprimación chimeric- multiplex PCR, que añade un 59 etiqueta universal a la secuencia de cebadores específicos para varios objetivos, se ha informado para mejorar el rendimiento y la eficiencia de la reacción en cadena de la polimerasa[21]​. Con su alta eficiencia en la detección de decenas de diferentes

productos de PCR en una reacción, el uso de cebador quimérico PCR con frecuencia se ha informado de su uso en la cuantificación de ARNm[22]​[23]​[24]​ y la detección de patógenos[25]​[26]​.

El cáncer de mama y cáncer de cuello uterino se han convertido en los cánceres más frecuentemente diagnosticados y las principales causas de muerte por cáncer entre las mujeres[27]​. Estudios recientes demuestran que las variantes somáticas en regiones de susceptibilidad están asociados con la probabilidad de ocurrencia de cáncer de mama y ginecológicos[28]​[29]​[30]​[31]​[32]​. SNPs fueron escogidos para este estudio sobre la base de asociaciones reportadas con estos tipos de cáncer y que tiene una razonablemente alta prevalencia en las poblaciones asiáticas. Se seleccionaron cuatro variantes de baja penetrancia para la predicción del riesgo de cáncer de mama. rs4784227 SNP[33]​ y rs3803662[34]​ se encuentran en el TOX3 factor de transcripción; rs1219648 se encuentra dentro de FGFR2, que contribuye al crecimiento celular, la invasión, la motilidad y la angiogénesis[35]​; rs889312[36]​ está dentro de MAP3K1, que está vinculada a la respuesta celular a los mitógenos. Se seleccionaron dos variantes asociadas con el riesgo de cáncer cervical o de ovario. rs750749 SNP[30]​ es un polimorfismos en CD83, que está implicado en el reconocimiento inmune y la presentación de antígenos; rs749292 en CYP19A1, que desempeña un papel clave en la biosíntesis de estrógenos[31]​[32]​. En este trabajo, se describe un nuevo múltiplex T-ARMS-PCR que permite el genotipado simultáneo de 6 SNPs (rs4784227, rs3803662, rs1219648, rs889312, rs750749 y rs749292) asociado con cánceres de mama y ginecológicos en un solo tubo utilizando 24 quimérico cebadores y un par de cebadores universales el uso de cebadores quiméricos y una estrategia de interruptor de temperatura PCR (TSP) se combinaron con T-ARMS-PCR para optimizar los parámetros de amplificación y mejorar el rendimiento de SNP genotipado. La combinación de estas diferentes técnicas de genotipificación de- muestra por primera vez la capacidad de tetra-primer ARMS-PCR para detectar de forma fiable y eficiente seis SNPs en una sola reacción. Desde hace más de 10 productos de PCR con longitudes diferentes deben ser identificados, electroforesis capilar (CE) se utiliza en lugar de la electroforesis en gel de agarosa.[9]​ Un total de 186 muestras de sangre de voluntarios sanos de sexo femenino chino que estaban siendo monitoreados para la hipertensión potencial se recogieron en los centros de salud comunitarios en Wuhan, China en 2011 para este estudio. Se llevaron a cabo todos los aspectos del estudio de acuerdo con las regulaciones nacionales de ética y aprobados por las Juntas de Revisión Institucional del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de China 70 de, así como el Comité de Ética de la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología. Los participantes recibieron '' consentimiento informado por escrito '' del propósito del estudio y de su derecho a mantener la información confidencial. Se obtuvo consentimiento escrito de todos los participantes o sus tutores.[9]​

ADN genómico fue extraído de 0,2 ml de muestras de sangre periférica frescas mediante el uso de la WizardH Genomic DNA Purification Kit (Promega) según las instrucciones del fabricante. muestras de ADN extraídas tenían una concentración final que oscila desde 55 hasta 365 ng / mL.[9]​

Para superar las limitaciones de los métodos estándar multiplex PCR Arms- T, el método propuesto se ha optimizado en términos de diseño de la cartilla, las condiciones de los ciclos de PCR y en la utilización de cebadores quiméricos y estrategia de TSP, tal como se describe en nuestros informes anteriores en la detección del virus de la gripe de pies y manos y la boca humana asociada agentes patógenos[37]​. Se utilizaron un total de 24 cebadores quiméricos cada uno consiste en una secuencia específica de gen con una secuencia de etiqueta universal en el extremo 59. Las porciones de genes específicos de los primers fueron diseñados de acuerdo con los requisitos de la T-ARMS-PCR. La especificidad de los cebadores específicos de alelo es conferido por la identidad del terminal 39 nucleótidos ya sea con el de tipo salvaje o el alelo mutante, la especificidad se incrementa por la introducción de una falta de coincidencia deliberada en la posición -1 de la 39-terminal. Un par de cebadores universales y seis juegos de T-Arms- PCR cebadores quiméricos fueron utilizados para la amplificación. Las secuencias de cebadores detalladas y las concentraciones de trabajo para cada SNP fueron enumerados.[9]​

El genotipado de los polimorfismos ensayados se realizó mediante amplificación por PCR multiplex y análisis de fragmentos. Seis juegos de cebadores T- ARMS-PCR para la amplificación de doce fragmentos de diferentes tamaños se combinaron en un solo 20 ml de volumen de reacción, que también contenían 10 ml de mezcla maestra kit Qiagen Multiplex PCR, 50-100 ng de ADN genómico, y las concentraciones de cada cebador optimizado (ver Tabla 1). Multiplex PCR se realizó utilizando Bioer LifePro termociclador. Una PCR (TSP) protocolo interruptor de temperatura optimizada, que utiliza cuatro temperatura de hibridación diferente se realizó como sigue: etapa de desnaturalización inicial de 95uC de 10 min, 3 ciclos de 95uC durante 30 s, 60uC durante 30 s, y72uC durante 45 s, 10 ciclos de 95uC durante 30 s, 58uC durante 30 s, y 72uC durante 45 s, 20 ciclos de 95uC durante 30 s, 68uC durante 30 s, y 72uC para 45s, 15cyclesof95uCfor30s, 55uCfor30s, and72uCfor45s, seguidos por un ciclo final de extensión a 72uC durante 10 min, y después se enfrió a 4uC.[9]​ Los productos de PCR múltiplex se separaron por ADN QIAxcelH cartucho de gel de alta resolución (Qiagen) en el sistema de QIAxcel (Qia- gen). ADN Tamaño de marcador de 25 a 450 pb (Qiagen) y alineación de marcador 15 pb / 500 pb (Qiagen) se utilizaron en cada QIAxcel se ejecuta y se determinó el tamaño de los productos mediante el software ScreenGel (Qiagen). Debido a que cada uno de los amplicones era de una longitud diferente, se detectaron los alelos sobre la base de los patrones de tamaños de pico. Un total de 186 muestras también fueron secuenciados en paralelo con un ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo BigDye versión 3.1 Terminación de Invitrogen Corporation (Shanghai, China) para confirmar los resultados T- múltiplex ARMS-PCR utilizando el cebadores externos que figuran en la tabla 1 para cada SNP. 

Un total de 186 muestras se tipificaron con un ensayo T-Arms- PCR multiplex y también escribe en paralelo con la secuenciación directa para evaluar la exactitud y la eficiencia del ensayo. Todos los productos de PCR fueron bien resueltos y dimensionadas por CE y ScreenGel, permitiendo la fácil identificación de los diferentes genotipos. Dos de las 186 muestras tenían once amplicones únicos, es decir, aquellos pacientes que tienen un solo SNP homogénea entre los seis loci analizados. imagen gel de estas dos muestras electroferograma y muestran que CE en QIAXEL puede separar claramente un máximo de 11 fragmentos en una muestra. La precisión de múltiples análisis de PCR de una muestra se confirmó por secuenciación directa. tamaños de los fragmentos determinados por la CE basada QIAXEL se enumeran en la Tabla 2. Leer las longitudes eran de 2 a 10 pb más grande que los esperados, pero esto no interfirió con la determinación de los alelos. Heterocigotos y homocigotos fueron asignados de forma inequívoca a partir de los perfiles de CE. No se observó reacción cruzada. Los genotipos obtenidos a partir del ensayo multiplex eran en 100% de acuerdo con la secuenciación directa.[9]​

Las frecuencias de distribución de genotipo y de los alelos de cada SNP se enumeran en la tabla 3. El alelo informado de que se asocia con el riesgo de aparición de cáncer se pone de relieve. La frecuencia observada de los genotipos en este estudio fue en general similar a la medida por HapMap para una población china Han (HCB). Si se utilizaron las frecuencias HapMap para predecir genotipo cuenta que se esperan de este estudio, a continuación, una comparación de esta población a la población HapMap HCB mostró divergencia significativa para rs4784227 en TOX3 y rs749292 en CYP19A1, en el que el riesgo y los alelos no de riesgo, respectivamente, están presentes en una proporción significativamente mayor que lo reportado previamente para una población china. Es probable que haya diversidad dentro de la población de Han que aún no es capturado por los estudios de HapMap. Se proporciona una tabla adicional para mostrar los conjuntos exactos de los alelos de los 6 SNPs que se encuentran en cada muestra individual para mayor referencia.[9]​

Métodos que permitan a bajo costo, la determinación rápida y fiable SNP están atrayendo a un creciente interés en la era de la medicina personalizada. Es ampliamente reconocido que el uso de la información de múltiples genotipos SNP proporciona una evaluación del riesgo más precisa que la predicha por un alelo único riesgo[38]​, por lo tanto, métodos capaces de identificar genotipos múltiples, tales como MALDI-TOF espectrometría de masas[39]​[40]​ y basado en la hibridación[41]​[42]​[43]​ o a base de enzimas se han utilizado[44]​ métodos. Sin embargo, estos métodos requieren equipo especial ya sea costosa, como espectrómetro de masas, o mucho tiempo después de la operación-PCR.

El método de tetra-cebadores ARMS-PCR se ha convertido en uno de los métodos más comúnmente utilizados para el genotipado de SNP. Sólo se requiere equipo de biología molecular regular y elimina la necesidad de hibridación o reacciones enzimáticas adicionales. Aunque se han reportado métodos tríplex y cuádruplex de PCR, se hace un uso limitado de múltiplex T-ARMS-PCR en la determinación del genotipo debido a dos limitaciones clave. En primer lugar, la probabilidad de encontrar cebadores con temperaturas de fusión emparejados cae drásticamente cuando se trata de combinar la detección de varios SNPs en una sola reacción. En segundo lugar, la piscina que resulta de los amplificados requiere suficientes intervalos de longitud entre bandas vecinas en la electroforesis para facilitar la separación. Mediante la combinación de T-ARMS-PCR con una estrategia quimérica basada en los iniciadores de temperatura de activación PCR eludimos en gran medida estas limitaciones. Nuestro método demuestra por primera vez la capacidad de tetra-primer ARMS-PCR para detectar fácilmente seis SNPs en una sola reacción.[9]​

La fiabilidad del método se ilustra escribiendo 186 muestras de sangre clínicas en paralelo con la secuenciación directa, y se obtuvo una consistencia de 100% entre los dos métodos. Por tanto, este estudio de prueba de concepto establece un método efectivo rápido, reproducible, y el coste para la detección de SNPs multiplex, ya que CE por QIAXCEL es capaz de resolver los amplicones con tan poco como 5 diferencia de tamaño pb, la diferencia de tamaño más pequeño en esta prueba fue de 10 pb. Como las longitudes de lectura en este ensayo tiene una desviación estándar de 0,8 a 1,3, la determinación de alelo se lo tanto no interferido. El uso de cebadores quiméricos y interruptor de temperatura bifásica en el proceso de recocido disminuye la diferencia en la eficiencia de amplificación entre amplicones. Durante los primeros pocos ciclos de PCR, la amplificación se lleva a cabo por los cebadores quiméricos específicos de alelo. En etapas posteriores de PCR, la amplificación se realiza predominantemente a por cebadores universales, de modo que todos los objetivos de este sistema de PCR multiplex se amplifican de una manera imparcial por un solo par de cebadores universales. Esto reduce la aparición de amplificación sesgada y parcial, reduce al mínimo las reacciones no específicas, y reduce la necesidad de la optimización de cada ensayo de PCR individual.[9]​

Para evaluar los errores resultantes de la utilización de electroforegramas multibanda para distinguir amplicones, la longitud de lectura de cada banda se comparó con las longitudes teóricos calculados a partir de imprimación-alineación (Tabla 2). No se observó superposición en el rango de longitud de lectura entre dos cualesquiera de los amplicones, adicionalmente aliado, no hay superposición de los intervalos de confianza del 99% de la longitud de lectura promedio observado. Es notable que la intensidad de la banda pueden ser objeto de varios factores, incluyendo la calidad del ADN genómico y PCR calidad de los reactivos; se ha encontrado que 50 a 100 ng / ml de ADN es óptima para proporcionar bandas suficientemente clara y brillante con el fondo mínima (datos no mostrados). Además, a diferencia de la mayoría de otros métodos informó T-ARMS-PCR, una falta de coincidencia deliberado en la posición -1 de la 39 terminal se incorporó en ambos cebadores internos y era suficientemente específico para la detección diferencial de dos alelos para cada SNP. Debido a la limitación de tamaño de la discriminación entre los productos de PCR, diseño de cebadores de PCR puede ser restringido en cierta medida, hacer múltiples T-ARMS-PCR difícil de escribir los SNPs que se encuentran más cerca que 20 pb de la otra.

Dos claras ventajas del método ARMS-PCR múltiple son el corto tiempo de ensayo y los bajos costos, incluso para ensayar un gran número de muestras. El método propuesto, solo que incluya la PCR convencional con un CE, puede llevarse a cabo antes de 3,5 horas con un mínimo esfuerzo práctico. Después de la extracción de ADN genómico, los pasos posteriores se pueden completar en un solo tubo de reacción, lo que permite el análisis de múltiples muestras listo en una única prueba para cribado de alto rendimiento. Este ensayo consume solamente reactivos de PCR estándar y cartuchos de electroforesis; los costos en este estudio fueron sólo 2 US $ para la detección simultánea de seis SNPs por muestra. Para nuestro conocimiento, el método propuesto es el primero en detectar seis SNPs en una única reacción usando tetra-primer ARMS-PCR. El nuevo método multiplex tetra-primer ARMS-PCR desarrollada en este estudio tiene un potencial significativo para ser ampliamente aplicable tanto en entornos comerciales y clínicas para la detección de múltiples SNPs.[9]​

El polimorfismo de nucleótido único (SNP) genotipificación se considera actualmente como una herramienta particularmente valiosa para el diagnóstico de diferentes patologías. Por esta razón, en los últimos años una gran cantidad de esfuerzo se ha dedicado al desarrollo de tecnologías precisas, rápidas y rentables para el análisis de SNP. A pesar de que un gran número de enfoques distintos se ha informado cada laboratorio utilice uno de los métodos publicados en función de su capacidad técnica y económica. En este artículo se presenta una aplicación de un ensayo en el local, BRAZOS tetra-primer ensayo de PCR, y su aplicación en la genotipificación de SNP. Hemos demostrado que este ensayo podría ser más ventajoso en comparación con la PCR-RFLP, PCR en tiempo real, y la secuenciación del ADN. Hemos demostrado que el ensayo tiene éxito en el genotipado usando tejidos embebidos en parafina archivados, muestras heparinated y líquido amniótico con meconio. Estos ensayos de baja presupuestado (3 $ / reacción) podrían completarse tras 3-4 horas después de la recepción de muestras que permite un tiempo razonable vuelco en el laboratorio. Desde BRAZOS tetra-primer ensayo de PCR no requiere ningún equipo especial, el ensayo se podría establecer en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico clínico.[45]​

Aplicaciones

PCR-ARMS e hibridación reversa en la detección de mutaciones en beta-thalassemia

Antecedentes: beta-talasemia es la enfermedad hereditaria más común en Irán y durante los últimos 10 años, el sistema de amplificación refractario a las mutaciones (ARMS) y el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) fueron la única técnica molecular utilizada para el diagnóstico de la enfermedad. Aunque existen muchas mutaciones del gen beta-globina en la población multiétnica de Irán, estas técnicas parecen mucho trabajo, mucho tiempo y es caro. Esto nos ha instado a utilizar nuevas técnicas como la hibridación inversa y secuenciación directa de este problema.[8]​

Métodos: En este estudio, hibridación inversa en paralelo con los brazos para la detección de las 10 mutaciones beta-talasemia más comunes y la hemoglobina S en 82 pacientes con diagnóstico clínico de menor importancia beta-talasemia y la mayor.[8]​

A partir de los resultados, 82 casos detectables por ambos métodos, 80 tuvieron resultados similares. En comparación a las armas, la hibridación inversa parece ser más fiable, rentable, rápido y aplicable.[8]​

Conclusión: teniendo en cuenta el amplio espectro de mutaciones beta-talasemia en Irán, una técnica rápida y fiable, como hibridación inversa representa ventajas vitales en comparación con los métodos de diagnóstico tradicionales. De hecho, se recomienda como la técnica de elección que puede ser empleada por el Proyecto Nacional de Talasemia para la detección y el diagnóstico prenatal de la talasemia beta en Irán.[8]​    

Identificación de SNPs comparando PCR-ARMS con PCR-RFLP

La identificación de polimorfismos de nucleótido único (SNP) es ahora posible mediante muchas técnicas, pero la elección de uno de estos métodos para un caso particular representa todo un reto, debido a que el investigador debe tener en cuenta muchos factores.[46]​

En este artículo los autores están tratando de presentar un estudio comparativo de dos métodos, que se utiliza actualmente en nuestro laboratorio, para la identificación de polimorfismos SNP: ARMS - PCR (sistema de mutación refractaria amplificación) y RFLP - PCR (restricción polimorfismo de longitud de fragmentos). Los dos SNPs en el que nos centramos pertenecen al gen VDR humano (gen del receptor de la vitamina D) y son ApaI (un cambio de base G → T en el intrón 8) y Taq I (T → cambio de base C silenciosa en el codón 352), el nombre de la enzimas de restricción que reconocen estas variaciones. [46]​

Dado que los resultados obtenidos por los dos métodos se confirmaron por secuenciación directa, concluimos que el método ARMS-PCR es el más adecuado para la detección de los genotipos alternativos determinados por mutaciones de una sola base. La simplicidad de este método lo hace adecuado para el análisis de gran número de muestras, situación que por lo general se cumple en casos y controles y estudios genéticos de población, porque esta prueba es fácil de usar, costo - efectiva y tener una precisión de 99,9% .[46]​

Biopsias clínicas

Se han comparado el análisis de mutación mediante secuenciación de ADN y amplificación refractaria mutación System ™ (ARMS ™) por su capacidad para detectar mutaciones en muestras de biopsia clínicos. Se han evaluado cinco en tiempo real ARMAS ensayos: BRAF 1799T> A, [esto incluye V600E y V600K] y las ANR 182A> G [Q61R] y 181c> A [Q61K] en el melanoma, el EGFR 2573T> G [L858R], 2235- 2249del15 [E746-A750del] en el cáncer de pulmón no de células pequeñas, y compararon los resultados con la secuenciación del ADN de la mutación 'puntos calientes' de estos genes en el tumor incluido en parafina y fijado en formalina ADN (FF-PET). Los ensayos ARMS maximizan el número de muestras que podrían analizarse cuando tanto la calidad y cantidad de ADN fue baja, y mejoraron tanto la sensibilidad y la velocidad de análisis en comparación con la secuenciación. Armas fue más robusta con menos fallos de reacción en comparación con la secuencia y fue más sensible, ya que fue capaz de detectar mutaciones funcionales que no fueron detectados por secuenciación del ADN. La secuenciación del ADN fue capaz de detectar un pequeño número de baja frecuencia mutaciones recurrentes a través de los exones seleccionados que no fueron interrogados usando los ensayos ARMS específicos en estos estudios. La PCR-ARMS fue más sensible y robusto en la detección de mutaciones somáticas definidos que la secuenciación de ADN en muestras clínicas en las que el tipo de muestra predominante fue FF-PET.[47]​    

Ventajas

Rápido, fiable y no isotópico. multiplexación solo tubo es posible con los ARMAS fluorescentes más recientes.[7]​

Desventajas

El formato original no distinguía entre homocigotos y heterocigotos, excepto por la mutación F508del. Sin embargo, BRAZOS fluorescentes pueden distinguir entre los homocigotos y heterocigotos.[7]​

Kits Comerciales

CF29v2, CF30, CF-polyT = ARMS múltiple (4 tubos, el número de cebadores en una única reacción); CF4v2 y CF-EU2 = ARMS fluorescentes múltiple (1 metro). Los dos ejemplos son kits que comercializa Gen-Probe Life Sciences.[7]​

Referencias

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