Reacción en cadena de la polimerasa múltiple

La Reacción en Cadena de la Polimerasa Múltiple (PCR Múltiple) es una variante de la PCR tradicional (PCR punto final) en la que dos o mas loci se amplifican simultáneamente en la misma reacción.​ Es una técnica de biología molecular usada en todo el mundo que usa la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar distintos fragmentos de ADN diana​ simultáneamente (como si se realizaran muchas reacciones en cadena de la polimerasa individuales en una misma reacción). La amplificación de las dianas se logra mediante el uso de múltiples pares de cebadores en una mezcla de reacción;​ el diseño de los cebadores para todos los pares de éstos tiene que ser optimizado para que pueden trabajar a la misma temperatura de hibridación durante la PCR. La PCR Múltiple tiene el potencial de ahorrar considerablemente tiempo y esfuerzo en el laboratorio, sin comprometer la utilidad del experimento.​ Desde su primera descripción en 1988, este método se ha aplicado con éxito en muchas áreas de diagnóstico de ácidos nucleicos, incluidos el análisis de deleción de genes, mutaciones, polimorfismos, ensayos cuantitativos, detección de RNA y PCR de transcripción inversa.​​ Kits de alcance comercial para realizar PCR Múltiple están disponibles y son utilizados por muchos laboratorios forenses para amplificar muestras de ADN degradadas. En el campo de las enfermedades infecciosas, esta técnica ha demostrado ser un método valioso para la identificación de virus, bacterias, hongos, y parásitos.​​

Historia

La PCR Múltiple fue descrita por primera vez en 1988 por Chamberlain, Gibbs, Ranier, Nguyen y Caskey como un método para detectar deleciones en el gen de la distrofina (uno de los genes humanos más largo que se conocen, con 2,5 megabases), que son la causa de la Distrofia Muscular de Duchenne.​  En 1990, Ballabio, Ranier, Chamberlain, Zollo, and Caskey la usaron como método de screening para encontrar deleciones en el gen de la esteroide sulfatasa (STS).​  En 2008, La PCR Múltiple fue utilizada para el análisis de microsatélites y SNPs,​ entre muchas otras áreas.

La PCR, en general, ha revolucionado el campo del diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Para superar la desventaja inherente del alto costo y para mejorar la capacidad diagnóstica de la prueba, se ha desarrollado la PCR Múltiple para la detección de agentes infecciosos virales, bacterianos y fúngicos en un tubo de reacción. Los esfuerzos para mejorar la sensibilidad y especificidad, y para facilitar la automatización del proceso han dado lugar a numerosas publicaciones relacionadas a la aplicación de la PCR Múltiple en el diagnóstico de agentes infecciosos, especialmente aquellos que se dirigen a ácidos nucleicos virales.​

Fundamento

La PCR Múltiple consta de varios conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de tamaños que son específicos para varias secuencias de ADN diferentes. Aunque no está claro si hay un límite teórico para el número de secuencias que pueden amplificarse simultáneamente, las limitaciones en el establecimiento de condiciones para reacciones específicas e interpretables generalmente limitan el número de secuencias diana útiles. Una reacción de PCR Múltiple para amplificar tanto como nueve segmentos del gen de la distrofina humana ya ha sido reportado con anterioridad.​

El desarrollo de la PCR Múltiple debería seguir un enfoque racional para sus condiciones, tales como la compatibilidad entre los cebadores dentro de la mezcla de reacción de tal manera que no haya interferencias entre ellos, lo cual es de gran importancia técnica.​  Por lo tanto, el diseño de los conjuntos de cebadores de acuerdo con unos parámetros claramente identificados es esencial para una amplificación específica con alto rendimiento.​

Las temperaturas de hibridación para cada uno de los conjuntos de cebadores deben ser optimizadas para que puedan funcionar correctamente dentro de una sola reacción, utilizando los pares de cebadores que resulten en productos de PCR que pueden ser separados y visualizados  claramente mediante electroforesis en gel o hibridación de sondas con máxima especificidad.​  Alternativamente, si los tamaños de los amplicones se superponen, los diferentes amplicones pueden diferenciarse y visualizarse usando cebadores que se han teñido con diferentes colores de marcas fluorescentes.​

Parámetros Importantes

Diseño de Cebadores

La longitud del cebador debe ser de 18 a 24 pares de bases y debe tener un contenido de GC de entre el 40 % y el 60 %, por lo tanto deberían de tener una temperatura de hibridación de 55°C a 58°C. Los cebadores más largos, de entre 28 y 30 pares de bases, permiten que la reacción se realice a una temperatura de hibridación más alta, pero los rendimientos de los productos resultarán ser inespecíficos, o se dará la formación de dímelos de cebadores. Se recomienda calcular el punto de fusión y hacer pruebas para posibles interacciones cebador-cebador. También se recomienda hacer pruebas de posibles secuencias repetitivas, intente alineación de cebadores con las bases de datos de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés) usando la familia de programas de la Herramienta de Búsqueda de Alineación Básica Local (BLAST, por sus siglas en inglés).​

Temperatura de Fusión

Se utilizan cebadores con la temperatura de fusión similar, preferiblemente entre 55°C y 60°C. Para las secuencias con alto contenido de GC, se recomiendan cebadores con una temperatura de fusión más alta (preferiblemente de 75°C a 80°C). Una variación de entre 3°C y 5°C es aceptable para los cebadores utilizados en la reacción.​

Especificidad

Es importante tener en cuenta la especificidad de los cebadores diseñados con las secuencias diana, mientras se realiza la preparación de una PCR Múltiple, sobre todo porque existe competencia cuando múltiples secuencias diana están en un sólo recipiente de reacción.​

Evitar la Formación de Dímeros de Cebadores

Los cebadores diseñados deben ser revisados para que no ocurra la formación de dímeros de cebadores, ya que con todos los que habrá presentes en la mezcla de reacción, si llega a haber dimerización, ésta conduce a la amplificación inespecífica de fragmentos.​

Evitar el Uso de Cebadores Anidados

Las PCR Múltiples deben evitar el uso de cebadores anidados que requieren una segunda ronda de amplificación. Esto es un importante contribuyente de los resultados con falsos positivos debido a la contaminación por arrastre, aunque protocolos anti-contaminación incluyendo controles de PCR (reacción y las muestras extraídas de controles) deben ser implementadas en todos los protocolos basados en la PCR. Del mismo modo, las precauciones y metodologías para evitar resultados falsos negativos debido a la insuficiencia de reacción tienen que ser considerados. Las PCR Múltiple que amplifican secuencias diana junto con la presencia de ácidos nucleicos diana de control externos o internos que indican la insuficiencia de reacción ya se han desarrollado y han sido también ampliamente utilizados.​

Tipos de PCR Múltiple

Las reacciones múltiples pueden ser categorizadas en dos grupos:

1. Reacción en Cadena de la Polimerasa de Templete Único

Esta técnica utiliza una única plantilla que puede ser un ADN genómico junto con varios pares de cebadores directo e inverso para amplificar regiones específicas dentro de un templete.​

2. Reacción en Cadena de la Polimerasa de Múltiples Templetes

Se utilizan múltiples plantillas y varios conjuntos de cebadores en el mismo tubo de reacción. La presencia de múltiples cebadores puede dar lugar a hibridación cruzada entre sí y así propiciar la posibilidad de errores de alineación con otras plantillas.​

Ventajas

1. Controles Internos

Los problemas potenciales en una PCR simple incluyen falsos negativos debido a alguna falla en reacción o falsos positivos debido a alguna contaminación. Los falsos negativos a menudo se revelan en ensayos múltiples porque cada amplicón proporciona un control interno para los otros fragmentos amplificados.​

2. Eficiencia

El gasto de los reactivos y el tiempo de preparación es menor en una PCR Múltiple que en los sistemas donde se utilizan varios tubos de PCR. Una reacción múltiple es ideal para la conservación de la polimerasa, que es costosa y de plantillas con escasa cantidad.​ 

3. Calidad del Templete

 La calidad el templete puede determinarse de manera más eficaz en una PCR Múltiple que en una reacción simple de PCR.​

4. Cantidad del Templete

La amplificación exponencial y los estándares internos de la PCR Múltiple se pueden utilizar para evaluar la cantidad de una plantilla determinada en una muestra. Para cuantificar las plantillas con precisión por PCR Múltiple, la cantidad de plantilla de referencia, el número de ciclos de reacción y la inhibición mínima de la duplicación teórica de producto para cada ciclo deben tenerse en cuenta.​

5. Cantidad Limitada de Templete

La cantidad de extracto disponible de ADN antiguo es limitado y sólo permite unos cuantos ensayos de PCR. El protocolo de la PCR Múltiple permite varios órdenes de magnitud de mayor información para ser deducidas de cantidades limitadas de plantilla. Esto se logra mediante la amplificación de un número casi ilimitado de fragmentos de la misma cantidad de plantilla de ADN como se utilizaría para un producto de PCR estándar único.​

6. Modificaciones

En primer lugar, debido a su alta especificidad cuando se utilizan cebadores anidados, un muy alto número de loci puede ser amplificado simultánea- y rápidamente sin la necesidad de la optimización previa de las diferentes combinaciones de cebadores. La alta especificidad es proporcionada por cebadores anidados, que imponen un nivel adicional de selección de secuencia en los productos de la primera PCR. Este diseño reduce sustancialmente la aparición de espurios de cebadores y falsos positivos debido a la amplificación no específica o amplificación de ADN contaminante a partir de especies diferentes a la especie objetivo. En segundo lugar, sólo los fragmentos más cortos (anidados) de la segunda etapa se amplifican a un alto número de copias. Por lo tanto, el riesgo de contaminación cruzada de muestras posteriores con productos de la PCR se reduce, ya que estos productos más cortos no pueden servir como plantillas para la primera etapa.​

7. Aplicaciones

Tales como la amplificación paralela de múltiples locis cortos que no presentan solapamiento, por lo que se puede utilizar un único conjunto de cebadores múltiples. La técnica también puede ser adaptada para el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), por ejemplo para inferir la selección positiva, la distribución geográfica de los alelos o cambios en la distribución del alelo en un tiempo y en un espacio determinados. Recientemente, se ha propuesto que la secuenciación de un genoma completo de una especie extinguida utilizando la técnica 454 proporcionará un gran número de SNPs para especies extintas. El protocolo de PCR Múltiple de dos etapas proporciona un método para la evaluación rápida de algunos SNPs candidatos y la posterior tipificación en paralelo de cientos o miles de SNPs de una muestra. Usando fuentes complejas de ADN, tales como las heces o sedimentos, también podría ser posible amplificar el ADN de especies diferentes, tales como plantas, animales y bacterias simultáneamente. Finalmente, este método tiene muchas aplicaciones en medicina forense, ya que permite el análisis simultáneo de múltiples marcadores tales como el ADN mitocondrial, los marcadores específicos del sexo, microsatélites y SNPs de las muestras de cantidad limitada.​

Desventajas

1. Número limitado de pares de cebadores

El número de pares de cebadores está limitado por el aumento de la posibilidad alineamiento incorrecto; aunque cabe mencionar que existen protocolos de PCR Múltiple en los que utilizan hasta 1,200 pares de cebadores y un solo templete de ADN y se ha logrado trabajar exitosamente.​

2. Optimización

La PCR Múltiple requiere de varios aspectos que requieren ser optimizados, como los componentes o las condiciones del termociclador, de acuerdo al tipo de experimento, investigación o diagnóstico que se desea realizar, y también para que se alcance una alta eficiencia y rendimiento.​

3. Validación

Antes de su aplicación en el diagnóstico clínico, las PCR Múltiple deben ser evaluadas por su sensibilidad en comparación con sus correspondientes PCR Simples usando diluciones en serie del ADN diana y muestras clínicas en ambas.​

Reactivos

Algunas soluciones y reactivos estándar para PCR Múltiple son:

Nucleótidos, desoxinucleótidos trifosfato o dNTP, que se almacenan como una solución stock de 100 mM (25 mM para dATP, 25 mM para dCTP, 25 mM para dGTP y 25 mM para dTTP).​

Amortiguador para PCR Estándar 10x , que deberá contener: 500 mM de KCl, 100 mM de Tris-HCl, pH ajustado a 8.3 (a 24ºC) y 15 mM de MgCl2.​

Taq ADN Polimerasa.​

Aditivos como dimetil sulfóxido o DMSO, albúmina de suero bovino o BSA y glicerol. ​

Cebadores que pueden ser adquiridos comercialmente o sintetizados localmente; debt ser utilizados a una concentración final recomendada de 10 a 25 pmol/µL cada uno y pueden combinarse en múltiples mezclas para la reacción.​

ADN Genómico que se recomienda que sea preparado utilizando un protocolo estandarizado de dodecil sulfato de sodio / proteinasa K.​

Algunos componentes de la PCR deben permanecer inalterados, ya que el aumento de la concentración de estos factores puede aumentar la probabilidad de alineamientos inespecíficos de los cebadores con la subsiguiente producción de productos de amplificación igualmente inespecíficos o espurios. Éstos son: componentes del tampón o amortiguador para PCR, nucleótidos y concentraciones de la polimerasa.​

Sin embargo, la optimización de estos componentes en PCR Múltiple, que están diseñados para la amplificación simultánea de múltiples objetivos, puede resultar beneficiosa debido a que el ADN diana deseado puede ser desplazado por la amplificación más eficiente de otras dianas (incluidos los productos no específicos), lo que lleva a la disminución de la eficiencia de la amplificación de los objetivos deseados y por lo tanto a la disminución en la sensibilidad de la reacción.​

Por ejemplo, en la PCR Múltiple utilizada para el gen de la distrofina (nueve dianas genómicas), una concentración de Taq ADN polimerasa (con un aumento apropiado de la concentración de MgCl2) de cuatro a cinco veces mayor que la requerida en la PCR Simple fue necesaria para lograr una óptima amplificación de ácidos nucleicos​.  

Otra técnica de optimización de los componentes es el uso de aditivos para PCR, tales como  dimetil sulfóxido, glicerol, albúmina de suero bovino o betaína, que han sido analizadas y se ha comprobado su carácter beneficioso para PCR Múltiple. Los componentes pueden actuar para prevenir el estancamiento de la polimerización de ADN, que puede ocurrir a través de la formación de estructuras secundarias dentro de las regiones de ADN molde durante el proceso de extensión. Tales co-disolventes también pueden actuar como agentes desestabilizadores, ayudando en la reducción de la temperatura de fusión de las secuencias ricas en GC, por poner un ejemplo.​

Protocolo de amplificación

Un protocolo de PCR Múltiple Paso-a-Paso fue diseñado por Henegariu, Heerema, Dlouhy, Vance y Vogt en 1997, con soluciones prácticas a muchos de los problemas que se encuentran en esta variante de la PCR.​ La combinación óptima de la temperatura de hibridación y la concentración de sal en el amortiguador es esencial en cualquier PCR para obtener productos de amplificación altamente específicos. La concentración de cloruro de magnesio solamente necesita ser proporcional a la cantidad de dNTP en la reacción, y estos valores pueden permanecer constantes para cualquier reacción. Aunque si las concentraciones de cloruro de magnesio se aumentaran gradualmente, podrían influir aún más la reacción, los otros dos parámetros mencionados parecen ser mucho más importantes en la obtención de altos rendimientos y alta especificidad de los productos de PCR. En la PCR Múltiple, ajustar la cantidad de cebador para cada locus también se ha demostrado ser esencial, entre muchos otros.​

Desarrollo de un sistema de PCR Múltiple

1. Escoger un loci​

Determinar el sistema de PCR a utilizar.​

Distribuir los amplicones (localizados en los “puntos calientes” o lugares donde frecuentemente ocurren mutaciones, ligados a genes, cromosomalmente no ligados, agrupados cerca de  exones en un mismo amplicón, etc…).​

Diseñar fragmentos de control interno (otros exones, secuencias externas, secuencias del modelo, secuencias conservadas en todos los templetes diana, etc…).​

2. Posicionar los Cebadores en regiones de secuencias detalladas; en relación al tamaño de los amplicones.​

3. Diseño de Cebadores con cinéticas de reacción similares.​

4. Desarrollar las Condiciones para PCR de manera separada para cada set de cebadores.​

5. Añadir Secuencialmente los sets de Cebadores, alterando las condiciones como sea necesario. Reducir las amplificaciones inespecíficas (hot start, detergentes iónicos, tiempos cortos de extensión, hibridación a la máxima temperatura posible, reseleccionar la secuencia de los cebadores). Variar las concentraciones relativas de los sets de cebadores para amplificación equivalente. Cambiar los sistemas de amortiguamiento si es necesario.​

6. Ajustar los componentes de la reacción y las condiciones del termociclador para la amplificación múltiple. Los requerimientos de Mg2+, dNTP y polimerasa pueden verse incrementados. Los tiempos para la extensión ideal pueden prolongarse un poco más de lo planeado.​

Aspectos Generales

La identificación de las especies objetivo debe ser realizada, las secuencias pueden ser recuperadas de bases de datos como GenBank. Partes de los genes tienen que ser secuenciadas para todas las especies diana utilizando cebadores. Las secuencias necesitan ser alineadas utilizando softwares disponibles para tal propósito, como por ejemplo BioEdit, y pares de cebadores específicos diseñados utilizando otros softwares como los que pone a disposición del público la empresa Premier Biosoft. Durante el diseño, los pares de cebadores deben ser equilibrados para temperaturas de fusión y se debe tratar de evitar la formación de dímeros cruzados.​

La PCR básica de 25 µL incluye: agua ultrafiltrada y autoclavada; amortiguador para PCR (1x); mezcla de dNTP (200 µM cada uno); cebadores (0.04–0.6 µM cada uno); DMSO, glicerol o BSA (5% - en caso de utilizarlos); Taq ADN polimerase (1–2 U/25µL) y templete de ADN genómico(150 ng/25 µL).​

Los componentes de la reacción pueden ser añadidos en orden indistinto siempre que se haya añadido primero el agua ultrafiltrada y autoclavada.​

Los fragmentos son amplificados a partir de la plantilla de ADN usando los cebadores diseñados, un fragmento de ADN se genera para cada diana incluida en la PCR Múltiple, que abarca los sitios de unión de cebadores específicos.​

Los productos de PCR se pueden limpiar con kits de purificación de PCR y la cantidad de ADN se puede medir utilizando equipos de cuantificación como espectrofotómetros. La cuantificación de ADN se debe determinar como el promedio de tres mediciones individuales de cada producto. El peso molecular de cada fragmento de doble cadena puede calcularse a partir de la secuencia de ADN correspondiente.​

Una evaluación minuciosa y una validación de nuevos procedimientos de PCR Múltiple es esencial. La sensibilidad y especificidad del método deben ser evaluados a fondo con el uso de ácidos nucleicos estandarizados, purificados. Se debe hacer un uso completo de controles de calidad internos y externos, que deben aplicarse rigurosamente. Cuando se trabaja con microorganismos, al aumentar el número de agentes microbianos detectables por la PCR, será altamente deseable para fines prácticos lograr la detección simultánea de múltiples agentes que causan síndromes clínicos similares o idénticos y que comparten características epidemiológicas similares.​

Los productos de PCR Múltiple pueden ser analizados por electroforesis en geles de agarosa en  TAE 1x (0,04 M Tris-acetato, 0,001 M EDTA, a pH 8,0) o TBE 1x (0,09 M Tris-borato, 0,002 M EDTA, a pH 8,0) amortiguador, a temperatura ambiente usando gradientes de tensión de 7-10 V / cm. Para cualquier análisis en gel, el mismo volumen de productos de la PCR se carga en cada pozo de gel; o en geles de secuenciación (6% de poliacrilamida, que se utilizan para la separación de los productos de PCR cuando se tienen polimorfismos o se requiere de una resolución más alta.​  Además, un sistema de electroforesis capilar automatizado se puede utilizar para realizar el mismo análisis, para la separación y visualización de productos de PCR, donde las diferencias de longitud del amplicón de tan sólo unas 20 pares de bases son adecuados para diferenciar entre dianas dentro del sistema Múltiple. Incluso hay aparatos que permiten la visualización en electroferogramas, donde las unidades fluorescentes relativas (RFU) proporcionan una medida de la intensidad de señal de los fragmentos detectados.​

Se puede ajustar el sistema Múltiple para obtener la misma eficiencia de amplificación de la siguiente manera: antes de la amplificación múltiple, todos los pares de cebadores requieren ser probados en PCRs Simples a la temperatura estimada de hibridación óptima para comprobar la correcta amplificación de los fragmentos deseados. Entonces, un primer sistema Múltiple provisional se prueba. Condiciones de 15 min a 95°C, 35 ciclos de 30ºC a 94°C, 90s a 62ºC a 65°C, 60s a 72°C y la elongación final por 10 min a 72°C, comprobando que no hay fragmentos adicionales producidos por cualquiera de los cebadores dentro del sistema Múltiple. El sistema Múltiple se prueba entonces en una PCR en gradiente con extractos individuales y una mezcla de todos los taxones diana para determinar la temperatura óptima de hibridación. Por último, las concentraciones de cebadores se ajustan por pasos disminuyendo aquellos pares que dieron lugar a las señales relativamente fuertes y aumentando los productores de bandas más débiles. El sistema Múltiple final, resulta en la fuerza equivalente de señales para todos los objetivos cuando se utiliza una mezcla de plantilla de ADN estandarizada.​

Para estimar la sensibilidad de los pares de cebadores en el sistema Múltiple, el número mínimo de copias de plantilla de doble hebra plantilla copias necesarias para amplificar un producto se identifica a todos los objetivos en diversas condiciones:​

1. Sólo un tipo de ADN diana como templete. ​
2. Una mezcla que contenga todas las dianas a concentraciones equimolares como plantilla.​
3. Un tipo de ADN diana como templere con 300 ng de ADN no diana.​
4. Una mezcla equimolar de todas las dianas con 300 ng de ADN no diana.​ 

Optimización

General

La optimización de la PCR Múltiple puede plantear varias dificultades, incluida la baja sensibilidad y especificidad, y la amplificación preferencial de ciertas dianas específicas. La presencia de más de un par de cebadores en la PCR Múltiple aumenta la probabilidad de obtener productos de amplificación no esenciales, principalmente debido a la formación de dímeros de cebadores.​  Estos productos inespecíficos pueden ser amplificados más eficientemente que la diana deseada, consumir los componentes de la reacción y producir tasas alternativas de hibridación y extensión.​  Uno de los conceptos más importantes en la PCR es el de la relación óptima entre el cebador y la plantilla. Si la relación es demasiado alta, se forman dímeros de cebadores, como ocurre también en condiciones de plantilla muy diluida o si existe un exceso de cebador. Para la mayoría de las aplicaciones, independientemente de la concentración de plantilla, la concentración de cebador no puede elevarse mucho más que 0,5 mM debido a la formación de dímeros. Por lo tanto, lo que determina la relación de cebador a la plantilla es la cantidad y la complejidad de la plantilla proporcionada a la reacción. Si la relación de cebador a la plantilla es demasiado baja, el producto no se acumulará de forma exponencial, desde hebras diana recién sintetizados volverán a hibridarse después de la desnaturalización (que reduce el rendimiento considerablemente), o inhibirá la formación de producto de PCR.​

Cuando más de una única diana será amplificada a partir de la plantilla, es necesario ajustar la relación de cebador-plantilla para evitar la formación de dímeros de cebadores. La optimización de PCR múltiple debe tratar de minimizar estas interacciones no específicas.​  Las pruebas empíricas y un enfoque de ensayo y error pueden tener que ser utilizados al probar varios pares de cebadores, porque no hay manera de predecir las características de funcionamiento de un par de cebadores seleccionado incluso entre aquellos que cumplen con los parámetros generales del diseño de cebadores.​ Tienen que ser considerados con especial atención los parámetros para el diseño de cebadores, como homología de los cebadores con sus secuencias diana de ácidos nucleicos, su longitud, su contenido en GC y su concentración.​

La PCR Hot Start a menudo elimina las reacciones inespecíficas causadas por hibridación de cebadores a bajas temperaturas (entre 4ºC y 25°C) antes del inicio del termociclado. Idealmente, todos los pares de cebadores en una PCR Múltiple deben permitir eficiencias de amplificación similares para sus respectivos ADN objetivos, que se logra mediante la utilización de cebadores con temperaturas de hibridación óptimas, casi idénticas y no deben mostrar una homología significativa ya sea para consigo mismos o entre ellos.​

Amplificación Preferencial

La amplificación preferencial de una secuencia diana sobre otra es un fenómeno conocido en la PCR Múltiple. Basado tanto en el modelado teórico como en los estudios experimentales, dos clases principales de procesos que inducen este sesgo han sido identificados: la deriva de PCR y la selección de PCR.​

La deriva de PCR es un sesgo supuestamente debido a la fluctuación estocástica en las interacciones de los reactivos de PCR, particularmente en los primeros ciclos, lo que podría surgir en la presencia de concentraciones muy bajas de la plantilla; variaciones en los perfiles térmicos del termociclador, resultando en temperaturas de rampa desiguales; o simplemente por algún error experimental.​

La selección de PCR se define como un mecanismo que favorece la amplificación de ciertas plantillas debido a las propiedades de la diana, las secuencias flanqueantes del objetivo, o de todo el genoma diana.​ Estas propiedades incluyen las diferencias entre regiones en el contenido de GC, lo que lleva a la desnaturalización preferencial; una mayor eficiencia de unión debido a cebadores ricos en GC; accesibilidad diferencial de los objetivos dentro de los genomas debido a estructuras secundarias; y el número de copias del gen dentro de un genoma. Además, la elección de cebadores se ha demostrado ser crucial para evitar la selección PCR.​

Componentes

Cebadores

Inicialmente, concentraciones equimolares de cebadores se utilizan en la PCR Múltiple. Cuando hay amplificación desigual, con algunos de los productos apenas visibles incluso después de que la reacción fue optimizada para las condiciones del ciclo, cambiando las proporciones de los diferentes cebadores en la reacción que se requiere, con un aumento en la cantidad de cebadores para los loci "débiles" y una disminución en la cantidad para los loci "fuertes". La concentración final de los cebadores puede variar considerablemente entre los loci y se establece empíricamente.​  Si hay un bajo número de copias o un ADN de alta complejidad, la concentración de los cebadores deberá rondar el 0.4 µM. Si hay un alto número de copias o un ADN de baja complejidad, la concentración de los cebadores debería de ser de entre 0.04 µM y 0.4 µM.​

dNTP y MgCl2

dNTP

La concentración de cloruro de magnesio se debe de mantener constante (2 mM), mientras que la concentración de dNTP se incrementa paso a paso desde 0,5 hasta 1,6 mM. Los mejores resultados se han reportado entre 200 mM y 400 mM de cada dNTP, valores por encima de este último han reflejado que la amplificación se inhibe rápidamente. Cuando se ha aplicado una baja concentración de dNTP (100 mM de cada uno) la amplificación por PCR se ha llevado a cabo generando cantidades visiblemente más bajas de productos. Los dNTP son sensibles a los ciclos de descongelación y congelación. Después de entre tres y cinco de dichos ciclos, la PCR múltiple no se realiza a una eficiencia recomendada. Para evitar estos problemas, pequeñas alícuotas de dNTP se pueden hacer y mantener congeladas a -20°C. Esta reducción en la estabilidad de los dNTP no es tan evidente cuando se amplifican loci individuales, o sea en PCR punto final.​​

MgCl2 

Una concentración recomendada de cloruro de magnesio en una PCR estándar es de 1.5 mM siempre que la concentración de dNTP sea de alrededor de 200 mM cada uno. Anteriormente se ha probado la influencia de cloruro de magnesio, manteniendo la concentración de dNTP a 200 mM y aumentando gradualmente cloruro de magnesio 1,8 a 10,8 mM; con esta última concentración de cloruro de magnesio, la amplificación se hizo más específica (bandas inespecíficas desaparecieron) y los productos adquirieron una intensidad comparable. En otras PCR con hasta 20 mM MgCl2, los productos apenas fueron distinguibles como si hubieran sido  inhibidos en las reacciones.​

Balance de dNTP/MgCl2

Para que funcione correctamente, la Taq ADN polimerasa requiere magnesio libre (además del magnesio obligado por el dNTP y el ADN); ésta es probablemente la razón por la que aumentar las concentraciones de dNTP puede inhibir rápidamente la PCR, mientras que los incrementos en la concentración de magnesio a menudo tienen efectos positivos. Mediante la combinación de varias cantidades de dNTP y MgCl2, se encontró que 200 mM de cada dNTP trabajó bien en 1,5-2 mM MgCl2. El umbral para la reacción fue de aproximadamente 0,5-1 mM MgCl2 sobre la concentración total de dNTP, con una reducción de la amplificación por PCR por debajo de esta concentración de MgCl2.​​

Amortiguador de PCR

El aumento de la concentración del tampón o amortiguador para PCR a 2X mejora la eficiencia de la reacción mútiple. Ésto fue más eficaz que cualquiera de los adyuvantes probados: sulfóxido de dimetilo (DMSO), glicerol y albúmina de suero bovino (BSA). Los pares de cebadores que resultaron en productos de amplificación más largos, fueron los que funcionan mejor en menores concentraciones de sales, mientras que los pares de cebadores con productos de amplificación cortos funcionan mejor en altas concentraciones de sal.​​

Comparación de amortiguadores

Dependiendo de los cebadores que se usen, el amortiguador basado en KCl es menos complejo y más fácil de ajustar y optimizar. Además, dado que la eficiencia de la Taq ADN polimerasa es mayor a concentraciones de dNTP inferiores, utilizando el amortiguador basado en KCl (que requiere mucho menos dNTP) puede ser beneficioso cuando los productos de PCR deben ser analizados más de mutaciones.​

Cantidad del Templete de ADN y Taq ADN Polimerasa

Cuando la cantidad de ADN molde es muy baja (pg de ADN), la amplificación puede hacerse más eficiente y específica mediante la reducción de la temperatura de hibridación hasta de 10°C y 12°C.​  Diferentes concentraciones de Taq ADN polimerasa han sido probadas con anterioridad y la más eficaz parece ser alrededor de 2,5 U / 50 L de volumen de reacción. La concentración excesiva de enzima, posiblemente debido a la alta concentración de glicerol en la solución, se traduce en una amplificación desequilibrada de diversos loci.​​  La tasa de extensión de los híbridos de los cebadores específicos depende de la actividad de la enzima, la disponibilidad de los componentes esenciales, tales como MgCl2, dNTPs y la naturaleza del ADN molde. Por lo tanto, la mayoría de las modificaciones para mejorar el rendimiento de PCR debe dirigirse a los factores que afectan las tasas de hibridación y amplificación.​

Aditivos: DMSO, Glicerol y BSA

Las reacciones más difíciles de PCR múltiple pueden ser mejoradas significativamente mediante el uso de un aditivo de PCR, tal como DMSO, glicerol, formamida y betaína, que relajan la doble hélice de ADN, haciendo así más fácil la desnaturalización del molde.​  Varios autores recomiendan DMSO y glicerol para mejorar la eficiencia de amplificación (mayor cantidad de producto) y especificidad (no hay productos inespecíficos) de la PCR, cuando se usa en concentraciones que varían entre 5% - 10% (vol / vol).​  En la PCR múltiple, la utilidad del DMSO y del glicerol necesita ser probada en cada caso. El BSA, en concentraciones de hasta 0,8 mg / L aumentó la eficiencia de la PCR mucho más que el DMSO o el glicerol.​  El BSA no tiene efectos inhibitors en los loci amplificados en los experimentos de Henegariu.​

Condiciones del termociclador

Las primeras rondas de ciclos térmicos tienen un efecto sustancial en la sensibilidad y la especificidad de la PCR. Suponiendo una desnaturalización eficiente de la diana, el éxito general de la amplificación específica depende de la velocidad a la que los cebadores hibridan con su objetivo y la velocidad a la que los cebadores hibridados se extienden a lo largo de la secuencia deseada durante los ciclos tempranos, medios y finales de la amplificación. Los factores que impiden que las tasas de hibridación sean las óptimas incluyen cebadores mal diseñados, componentes de amortiguación debajo de los niveles óptimos y temperatura de hibridación. La tasa de extensión de los híbridos de los cebadores específicos depende de la actividad de la enzima, la disponibilidad de los componentes esenciales, tales como dNTPs y la naturaleza del ADN diana. Por lo tanto, la mayoría de las modificaciones para mejorar el rendimiento de PCR se han dirigido hacia los factores que afectan las tasas de hibridación y extensión.​

Temperatura de Extensión

En las pruebas hechas en 1997 por el equipo de Henegariu, los resultados obtenidos cuando cuatro mezclas de amplificación diferentes que contienen cantidades iguales de diferentes cebadores fueron sometidos a PCR múltiple con el programa A y el programa B; este último programa tenía una temperatura más alta de extensión (72°C) y a tiempos de hibridación y de extensión más largos. En general, hubo un rendimiento visiblemente más alto de productos de PCR con el programa A. Además, con el programa B, algunos productos se perdieron y algunos productos no específicos sí aparecieron. Los resultados con el programa B se consideraron menos deseables en general y sugirieron que la temperatura de extensión mayor en el programa B disminuyó la amplificación de algunos loci, a pesar de que fue probado para compensar el uso de un tiempo de hibridación más largo y tiempo de extensión ligeramente más largo de lo normal.​

Tiempo de Extensión

En la PCR múltiple, a medida que la amplificación simultánea de los loci va aumentando, la cantidad de enzima y de los nucleótidos se convierte en un factor limitante y es necesario más tiempo de extensión para que la polimerasa pueda completar la síntesis de todos los productos. Dos experimentos han ilustrado la influencia de la optimización del tiempo de extensión. En un experimento, se añadió un par de cebadores del cromosoma Y (Y6BaH34pr, 910bp) a una mezcla de cebadores del cromosoma X (X-3). Los resultados mostraron que el aumento del tiempo de extensión en la PCR múltiple (programa A vs. programa D) aumentó la cantidad de productos más largos. En otro experimento, cuatro mezclas múltiples para el cromosoma Y fueron amplificados con rendimientos visiblemente más altos utilizando los programas C y A con tiempos de extensión más altos.​

Tiempo y Temperatura de Hibridación

Se ha demostrado que la modificación del tiempo de hibridación de 20 s a 2 min no altera la eficiencia de amplificación.​ La temperatura de hibridación es uno de los parámetros más importantes. Aunque muchos loci individuales podrían ser amplificados específicamente a 56ºC - 60°C, la reducción de la temperatura de recocido por 4ºC - 6°C se requiere para el mismo loci para ser co-amplificado en mezclas múltiples. Cuando muchos loci específicos se amplifican simultáneamente, los loci amplificados de manera más eficiente influirán negativamente en el rendimiento del producto de los loci menos eficiente. Esto es debido al hecho de que la PCR tiene un suministro limitado de enzima y nucleótidos, y todos los productos compiten por el mismo grupo de suministros.​

Geles

Agarosa

Los productos de PCR múltiple, que difieren entre sí en un 30 pares de bases a 40 pares de bases de longitud podrían ser convenientemente separados en geles de uso común de agarosa al 3%. Realizar la separación de los productos en gradientes durante la noche disminuye la nitidez de las bandas individuales de PCR, especialmente cuando los productos son más pequeños que 400 pares de bases a 500 pares de bases.​

Poliacrilamida

Para separar los productos de PCR que difieren en sólo unos pocos pares de bases de longitud (por ejemplo, marcadores de microsatélites), se requieren de geles de poliacrilamida (PAA) de entre 6% y 10%. Considerando que los geles de PAA no desnaturalizantes funcionan muy bien para loci no polimórficos, bandas inusuales aparecen cuando los microsatélites se separan en este tipo de gel. Por ejemplo, en un análisis de algunos loci polimórficos del cromosoma 12 a partir de dos hibridomas, se encontraron 2 bandas en el gel de PAA no desnaturalizante.​

Modificaciones

Múltiples técnicas, incluyendo RT-PCR, PCR punto final, PCR en tiempo real, Reacción en Cadena de la Ligasa y la Amplificación Mediada por Transcripción, se han desarrollado para amplificar y detectar genes de una manera similar para ensayos múltiples. Por ejemplo, la fusión de genes específicos observados en los tumores sólidos son marcadores de diagnóstico extremadamente útiles. Un ensayo basado en multiplexación de cebadores y sondas utilizando PCR en tiempo real, que permite la detección (bajo condiciones idénticas de PCR) de las diferentes fusiones, fue utilizado para el diagnóstico genético de rutina de células tumorales. La ventaja de este análisis de fluorescencia múltiple de translocaciones cromosómicas es que este método disminuye la manipulación de productos de PCR y reduce considerablemente el riesgo de contaminación cruzada vinculado al arrastre de los productos de RT-PCR. Además, constituye un paso importante hacia la automatización de la detección de la fusión génica específica del cáncer. La reacción en cadena de la ligasa (LCR) implica ciclos repetitivos de la ligadura de dos pares adyacentes de oligonucleótidos para formar productos ligados durante más tiempo en una técnica dependiente del molde. Se ha reportado que la LCR Múltiple es útil para la determinación simultánea de alelos normales y mutantes causantes de fibrosis quística. Una discriminación de mutaciones se logró utilizando LCR competitivo con seis oligonucleótidos y con una LCR múltiple competitiva usando 12 oligonucleótidos para detectar ambos alelos para dos mutaciones en un solo tubo de PCR. Aunque los equipos que ofrecen diversos grados de automatización se han adaptado a estas técnicas, la automatización completa no está disponible todavía.​

PCR Múltiple Anidada

Este tipo de ensayo implica el uso simultáneo de un par de cebadores universales, un par de cebadores específicos para un control interno (anidado) y un par de cebadores que no son específicos para la especie que se desea investigar. La especificidad de cada cebador debe ser evaluada en silicio, empíricamente, y verificada adicionalmente mediante secuenciación de los productos de amplificación. Por ejemplo un par de cebadores específicos para ARN ribosomal de la subunidad 18S, cinco cebadores internos (anidados) oligonucleótidos específicos para los genes de la subunidad 18S del ARN ribosomal universales para el par de cebadores iniciales y un cebador específico para la especie en cuestión que no esté anidado.​

Este método se utilizó para discriminar entre seis larvas de bivalvos comúnes en las aguas costeras danesas (Cerastoderma edule, Macoma balthica, Mytilus edulis, Spisula subtruncata, Ensis americanus y miembros de la orden Myoida). Identificación individual de larvas de bivalvos aislados a partir de muestras de plancton se basa en el tamaño del producto de PCR producido por los cebadores específicos después de la visualización por electroforesis en gel de agarosa. Los estudios preliminares indicaron que este método es adecuado para su uso con muestra recién recogida y larvas conservadas y es, por tanto, adecuado para su aplicación en el campo.​

PCR Múltiple Anidada en Tiempo Real

Una Reacción en Cadena de la Polimerasa Múltiple Anidada fue adaptada a un sistema de tiempo real para la detección del virus del herpes simple (tipos 1 y 2) y el virus de varicela zoster, los resultados fueron comparados usando electroforesis en gel de agarosa. Se encontró que es una alternativa conveniente a la PCR convencional. Se mejora el tiempo de respuesta del espécimen mediante la eliminación de la necesidad de la electroforesis en gel, transiluminación y la fotografía del gel. También muestra aumento de la sensibilidad en los ensayos estándar y reduce aún más la posibilidad de contaminación de amplicones con protocolos de PCR anidadas.​

PCR Múltiple Anidada con Transcripción Inversa

Este enfoque incluye conjuntos de cebadores anidados dirigidos a conservar las regiones de genes de virus humanos, los cuales se transcriben mediante Transcripción Inversa al mismo tiempo que los controles internos lo hacen de la manera convencional.​

Como es necesario un diagnóstico rápido, sensible y preciso de infecciones de las vías respiratorias inferiores en los niños, pacientes inmunocomprometidos y ancianos, el ensayo de PCR Múltiple Anidada con Transcripción Inversa se ha utilizado ampliamente para la detección simultánea de los virus no relacionados implicados en enfermedades infecciosas a causa de su alta especificidad y sensibilidad. Comparando sus resultados con cultivos convencionales virales, ensayo de inmunofluorescencia y una RT-PCR Múltiple para todos los tipos de virus de parainfluenza humanos, los ensayos de RT-PCR Múltiple Anidada proporcionan un sistema capaz de detectar e identificar simultáneamente 14 virus respiratorios diferentes en muestras clínicas con alta sensibilidad y especificidad, siendo útiles para el diagnóstico de rutina y el control de estos virus dentro de la población.​

PCR Múltiple Tiempo Real

La PCR Múltiple tiempo real basada en tecnología TaqMan fue desarrollada para identificar el locus ttrRSBCA y el gen invA para la detección precisa de Salmonella spp. en los productos frescos y los huevos. Con el fin de reforzar la especificidad del ensayo de PCR cuantitativa para Salmonella, una PCR Múltiple cuantitativa (tiempo real) dirigida específicamente al gen y locus mencionados anteriormente fue evaluada, obteniendo resultados concluyentes sobre su sensibilidad y especificidad.​

La contaminación de los alimentos, sobre todo los huevos, con Salmonella spp. es una gran preocupación para la salud pública. Por lo tanto es urgente el desarrollo de un método rápido para la detección de Salmonella en los productos alimenticios importantes. El ensayo de PCR  Múltiple Cuantitativa desarrollado en este estudio permite la detección rápida y precisa de Salmonella spp. en seis materias primas de alto riesgo y en huevos y tiene el potencial necesario para ser utilizado con otras matrices alimentarias.​

PCR Múltiple Cuantitativa basada en Arreglo de DNA

La PCR Múltiple Cuantitativa basada en un Arreglo de ADN (MQDA-PCR) es muy general y se puede utilizar en todas las áreas de las ciencias biológicas donde se desea realizar la cuantificación simultánea de múltiples genes objetivos. El método se basa en una PCR de dos etapas. En los primeros ciclos se emplean cebadores bipartitos que contienen una región universal en el extremo 5’ y una región universal específica en el extremo 3’ para cada constructo modificado genéticamente. Los cebadores utilizados son entonces degradados con una exonucleasa de cadena única específica para ADN. El segundo paso de la PCR se ejecuta sólo  con cebadores que consisten en la región del extremo 5’. La eliminación de los cebadores es esencial para crear una PCR competitiva y, por lo tanto, cuantitativa. Los oligonucleótidos que se hibridan a segmentos internos de los productos de PCR, son entonces marcados en una secuencia específica en una reacción de amplificación lineal con una señal cíclica. Esto se hace tanto para aumentar la sensibilidad como la especificidad del ensayo. La hibridación de los oligonucleótidos marcados a sus secuencias complementarias en una matriz de ADN permite la detección múltiple.​

Este método fue desarrollado y evaluado por Knut Rudi y su equipo en 2003 para la cuantificación de maíz transgénico en alimentos y piensos. Diecisiete muestras de alimentos y piensos diferentes fueron seleccionados utilizando un sistema múltiple (específicamente de doce) para la detección simultánea de siete tipos diferentes de maíz genéticamente modificados (Bt 176, Bt11, MON810, T25, GA21, CBH351 y DBT418). Diez muestras fueron modificadas genéticamente para tener controles positivos que contiene principalmente mezclas de MON810 y Bt11 ADN Bt176. Un sistema MQDA-PCR de ocho complejos para la detección del maíz MON810, Bt11 y Bt176 fue evaluado haciendo una comparación con un sistema simple de PCR que actúa con una nucleasa que corta en el extremo 5’. Llegaron a la conclusión de que el método descrito es modular, y por lo tanto adecuado para las necesidades futuras en la detección de organismos genéticamente modificados.​

PCR Múltiple en Tiempo Real con Transcripción Inversa

Un protocolo de PCR Múltiple en tiempo real utilizando primers específicos de ciertos genes y sondas TaqMan ofrece genotipificación y cuantificación simultánea de esos genes con una sensibilidad aceptable.​

Este método fue utilizado por Kottaridi, Spathis, Ntova, Papaevangelou y Karakitsos en 2012 para la detección y cuantificación de los genotipos más comunes de rotavirus humanos debido a que el grupo A de rotavirus (RVs) son patógenos importantes que causan deshidratación y gastroenteritis agudas en lactantes y niños pequeños. Ellos fueron capaces de detectar cepas de rotavirus con las combinaciones de genotipo más común G4P (70,7%), G1P (10,9%), G2P (5,4%) y G9P (2,2%).​

PCR Múltiple en Tiempo Real con Transcripción Inversa usando sondas TaqMan

Ensayos de PCR Múltiple en Tiempo Real con Transcripción Inversa usando sondas TaqMan individuales se desarrollaron y evaluaron con un ensayo de TaqMan RT-PCR tiempo real por Tineke y sus colaboradores en 2009 con un Control de Procesos de Muestras para la Detección de ARN F-específicos de Genogrupos de Colifago I y IV, lo que resulta en la detección exitosa de genogrupo IV con el ensayo multiplexado en el 80% de las muestras fecales. El desarrollo de este método se debe a la creciente preocupación de la transmisión zoonótica de algunos virus entéricos animales, como calicivirus, virus de la hepatitis E y el rotavirus, que están estrechamente relacionados con las cepas patógenas humanas.​

PCR Múltiple-Ready

PCR Múltiple-Ready puede lograr una alta tasa de éxito (92%) para la amplificación de secuencias publicadas bajo condiciones de reacción estándar, con una especificidad comparable a la de los métodos de PCR convencionales. Es compatible con un nivel más elevado de multiplexación en los genomas de plantas de diferentes tamaños y la ploidía, sin la necesidad de optimizar cuidadosamente las condiciones de ensayo. Varias ventajas de la PCR Múltiple-Ready para el genotipado de SNP y SSR incluyen la amplificación uniforme de secuencias diana dentro de las reacciones multiplexadas y entre ensayos independientes, y la capacidad de etiquetar amplicones durante la PCR con restos especializados, tales como los marcadores fluorescentes y la biotina. Este nuevo método de PCR múltiple facilita el genotipificado de SSR basado en la fluorescencia y la preparación multiplexada de moldes de ADN para ensayos de SNP. Estas ventajas pueden ser capturadas en varios puntos en el proceso de determinación del genotipo y ofrecen un considerable ahorro de costos y de trabajo. La PCR Múltiple-Ready es ampliamente aplicable a la genómica de plantas y asistida por marcadores de cría, y debería ser transferible a cualquier especie animal o vegetal, sin embargo esto no ha sido comprobado todavía.​