Pirosecuenciación

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La pirosecuenciación o secuenciación 454, de 454 Life Sciences, es una tecnología de determinación de secuencia de ADN a gran escala, aplicable a genomas completos, mediante luminiscencia. A diferencia del sistema de Sanger, capaz de resolver 67.000 bases cada hora,[1] el método 454 puede determinar la secuencia de 20 millones en 4,5 horas, lo cual abarata enormemente el coste del proceso.[2]

Fundamento[editar]

La muestra biológica se carga en una placa «PicoTiterPlate Device», de fibra óptica, que permite transmitir la luz producida por quimioluminiscencia durante la reacción de secuenciación hasta la cámara CCD de captación de imágenes. Dicha placa, en forma de panal, posee multitud de pocillos.

La particularidad es el tamaño del ADN a secuenciar en cada pocillo: debe ser entre a 500 y 1000 nucleótidos. La genoteca de ADN genómico con la cual comenzar la secuenciación se carga en la placa; en ella, cada fragmento se amplifica de forma aislada mediante emPCR o PCR basada en emulsión de modo que se amplifique hasta 10 millones de veces; este incremento facilita la detección de la señal.[2]

El fundamento de la secuenciación se basa en controlar el flujo secuencial y cíclico de nucleótidos sobre la placa en combinación con un sistema de detección bioluminiscente que permite convertir los productos generados durante la incorporación de nucleótidos (pirofosfato) en luz (por medio de la luciferasa) que es detectable por el dispositivo CCD.

Luminiscencia[editar]

La inyección de los dNTPs en cada pocillo acarrea la interacción con al menos un nucleótido complementario al situado en ese punto del ADN de secuencia desconocida; esto es que para cada punto de la secuencia sólo un dNTP puede ser individualmente unido de forma correcta, y cada vez que esto sucede el establecimiento de un enlace químico provoca la liberación de una molécula de pirofosfato.[1]

En cada pocillo de la placa PicoTiter se añade, además del ADN molde, la polimerasa que va incorporando las bases complementarias de la secuencia. Al añadirlas, se produce el pirofosfato, el cual mediante la enzima sulfurilasa es transfomado en ATP. Este ATP es cogido por la enzima luciferasa que al unírselo a la luciferina, genera un haz de luz que indica la secuencia para ese punto. Tampoco nos podemos olvidar el papel de la enzima apirasa, esta enzima es la encargada de degradar aquellos nucleótidos que no han sido incorporados y quedan sueltos, con el fin de que al añadir un nuevo dNTP, no existan restos de reacciones anteriores.[2]

Procedimiento[editar]

  • Mediante una emulsión se generan microreactores (microesferas); se intenta que en cada microesfera haya un único fragmento de ADN.
  • En cada microreactor se encuentran los elementos necesarios para la reacción de PCR: iniciadores, dNTPs, polimerasa, cuentas de secuenciación y, por lo común, un único fragmento de ADN molde.
  • Mediante la amplificación por PCR, se generan muchas copias del mismo fragmento de ADN original.
  • Después se liberan las cuentas de la emulsión y se colocan en placas donde se procede con la secuenciación en paralelo. Para realizar la secuenciación se vierte la emulsión sobre una fase sólida con celdillas. Tras añadir las microesferas se incorporan esferas que inmovilizan a estas y se realiza en cada celdilla una pirosecuenciación. La secuenciación se realiza en paralelo añadiendo uno de los cuatro nucelótidos y observando qué celdilla se ilumina, se lava y se añade el siguiente nucleótido (se repite el mismo proceso hasta completar la secuencia).

Aplicaciones[editar]

Es una técnica que se utiliza mucho en el diagnóstico molecular, sobre todo cuando ya se sabe de antemano la secuencia que se desea obtener, aunque también se utiliza para obtener la secuencia de un ADN problema. En el caso de no conocer la secuencia en particular, al máquina va liberando por orden las bases A, T, C, G. El resultado nos otorgará un patrón de picos que tendremos que interpretar. La altura de los picos indicará el número de bases de un tipo determinado que se ha unido, de modo que podremos interpretar picos de una base, de dos bases, de tres bases etc. Si estamos en el caso de que ya conocemos de antemano la secuencia, lo que haremos será liberar las bases que sabemos que debe tener nuestra secuencia, por orden. Muchas veces se realiza la pirosecuenciación para detectar una mutación puntual en la muestra. Para ello, sabiendo de que mutación se trata, podemos realizar dos experimentos: uno con la secuencia control, a la que se añaden los nucleótidos normales que debe contener ese ADN, y por otro lado, el ADN problema, cuya mutación conocemos y podemos añadir directamente en los nucleótidos. Esto, además de permitirnos averiguar si el paciente es mutante, nos permitirá ver si es homocigoto sano o enfermo, o si es heterocigoto.

Implicaciones[editar]

Su bajo coste y velocidad, que permitió a la compañía secuenciar el código de un adenovirus en 2003 en un sólo día,[1] plantea la posibilidad de secuenciar genomas completos de forma rutinaria, lo cual es de especial interés en biomedicina. De hecho, el genoma de James Watson, codescubridor de la estructura del ADN, fue descrito y publicado mediante esta técnica.[3]

Esta técnica se emplea para realizar tipajes de organismos infecciosos y para tipajes HLA.

Ventajas[editar]

Algunas de las ventajas de la pirosecuenciación son que no es necesario usar geles, marcadores fluorescentes o ddNTPs.

Referencias[editar]

  1. a b c Cristina de Martos. «Más cerca de la secuenciación personalizada del ADN» (en español). Consultado el 15 diciembre de 2007.
  2. a b c «454 Life Sciences» (en inglés). Consultado el 15 diciembre de 2007.
  3. «James Watson's Personal Genome Sequence» (en inglés).

Enlaces externos[editar]