Hibridación genómica comparada

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La hibridación genómica comparada o CGH (de sus siglas en inglés Comparative Genomic Hybridization) es una técnica citogenética mediante la cual es posible identificar y analizar alteraciones genéticas del tipo de ganancia o pérdida de material genético en una muestra de DNA en comparación con una muestra de referencia.[1] La finalidad de esta técnica es la comparación de DNA genómico de dos muestras en condiciones distintas (normalmente una es el control y otra el test), sin necesidad de pasar por un cultivo celular previo al análisis. El CGH permite, por ejemplo, la exploración de los 46 cromosomas humanos en un solo ensayo experimental, para el estudio de posibles duplicaciones o deleciones, incluso a escala microscópica, lo que además permite la identificación de genes o regiones cromosómicas responsables de un fenotipo determinado. En consecuencia, el CGH tiene un amplio uso en estudios genéticos preimplantacionales y prenatales,así como estudios del cáncer o en biotecnología animal para el estudio de variaciones en el número de copias (CNV).[2] [3] [4]

Método[editar]

El método consiste en la hibridación de un ADN control o de referencia y otro ADN muestra a estudiar. Cada uno de estos se marca con una sonda fluorescente distinta para poder identificar mediante la comparación de ambos, posibles deleciones o duplicaciones genéticas. Al marcaje para cada muestra es distinto, ya que así podremos distinguir y comparar ambas:

  • ADN-M o muestra: usualmente se marca con una sonda fluorescente, Cy3, que reporta color verde. Su longitud de onda de absorción es de 532 nm y de excitación es de 550-600 nm.
  • ADN-C o control: usualmente se marca con una sonda fluorescente, Cy5, que reporta color rojo. Su longitud de onda de absorción es de 635 nm y de excitación es de 655-695 nm.

Tras marcar ambas muestras, se excitan a diferentes longitudes de onda y se comparan los resultados obtenidos para cada fluorocromo. De modo que si en una zona del cromosoma reporta una mayor cantidad de fluorescencia verde, se interpretará como mayor proporción de ADN muestra, relacionándose con una duplicación. Si por el contrario, la mayor excitación se reporta en color rojo en una zona del cromosoma, se identificará con una mayor proporción de ADN control. Pero debemos tener en cuenta que este ADN control tiene una dotación genética normal, es decir, sin duplicaciones ni deleciones, por lo que no se interpretaría como una mayor proporción de ADN control, sino como una menor proporción de ADN muestra, o lo que es lo mismo, como una deleción. Finalmente, una relación 1:1 en la excitación de ambas muestras, indica una misma cantidad de ADN.

Todas estas variaciones se miden bien mediante un microscopio de fluorescencia (para CGH en metafase) o bien con un software específico que muestra los resultados en una escala logarítmica(para arrays de CGH). En el caso de los arrays, no se suele obtener una fluorescencia totalmente equivalente por diversos motivos como por ejemplo por pequeñas variaciones de unión de estos marcadores, pero esto no quiere decir que esté presente una variación genética. Por este motivo, el software marca una línea base a partir de la cual se considera que ambas muestras presentan diferencias genéticas. Esta línea se marca mediante un ensayo previo, en el que se comparan dos muestras equivalentes y se observa la fluctuación de fluorescencia, el rango logarítmico en el que estas varíen se toma como línea base de referencia.[2]

Tipos de CGH[editar]

CGH convencional[editar]

Este tipo de CGH tiene una resolución de 5-20Mb, por lo que se pueden distinguir pequeñas variaciones cromosómicas. Para este tipo de CGH contamos con tres muestras de ADN distintas:

  • El ADN de la muestra a estudiar, el cual se marca de verde.
  • El ADN de un control (cariotipo normal), el cual se marca de rojo.
  • Cromosomas en metafase de un cariotipo normal (se suele utilizar cromosomas de un individuo 46 XY para que estén presentes ambos cromosomas sexuales)

Los cromosomas en metafase se fijan a un porta y se marcan con DAPI de modo que se verán de color azul bajo el microscopio de fluorescencia. Tras esto, se mezclan ADN muestra y ADN control en cantidades equimolares, previamente marcados con fluoróforos distintos. Finalmente se realiza una hibridación in situ de esta mezcla con los cromosomas metafásicos previamente fijados y marcados con DAPI. Estos ADNs competirán por hibridar en los mismos sitios, reportando una fluorescencia amarilla (rojo+verde) en los lugares del cromosoma en los que ambas muestras se encuentren en una proporción normal. Si la muestra a estudiar contiene una deleción, se observará un color rojo (ausencia del citocromo verde que es el que tiene la muestra).O si por el contrario, hay una duplicación, se observará una emisión verde.[3]

Siempre hay que tener en cuenta que el color de los cromosomas sexuales X e Y, variarán dependiendo del sexo de los individuos de la muestra y los controles.

Este tipo de CGH se utiliza principalmente en cáncer, ya que en las últimas fases de esta enfermedad se acumulan anomalías cromosómicas.

CGH en array (aCGH)[editar]

Este tipo de CGH difiere con el anterior principalmente en que es capaz de detectar variaciones de un menor número de kilobases (kb), en que no es necesario obtener las muestras en metafase y en que el procesamiento de los datos obtenidos se realiza por medio de un software específico.

Este tipo de CGH presenta mayor resolución que la CGH en metafase (150kb o incluso genes frente a 5-20Mb).

Parte de un microarray

Un array se compone de múltiples pocillos, y en este caso, cada uno de ellos contiene fragmentos genómicos inmovilizados (procedentes normalmente de YACs o BACs). De esta manera se aumenta el número de copias diana. Al igual que la técnica anterior, marcamos el ADN de la muestra de un color, y el ADN del control de otro e hibridamos en todos los pocillos del array.

  • Si hay la misma cantidad de ADN en el control y en la muestra, el color del pocillo será amarillo
  • Si hay más cantidad de ADN del control (microdeleción del ADN de la muestra), el pocillo tendrá el color del que hemos marcado la muestra
  • Si hay más cantidad de ADN de la muestra (microamplificación del ADN de la muestra), el pocillo se teñirá del color del que hayamos marcado dicha muestra

Se suele añadir ADN Cot-I, que es un ADN de origen placentario enriquecido en secuencias repetitivas, para así bloquear la hibridación no específica. Además, el tipo de clon nos va a limitar la sensibilidad y el tipo de resultados que obtengamos.

Los arrays de CGH son mucho más precisos que los CGH en metafase pudiéndose distinguir con precisión los puntos de corte de las alteraciones cromosómicas, así como pequeñas deleciones o duplicaciones que con los de metafase no podían ser distinguibles, por su menor resolución. [5]

Aplicaciones[editar]

Investigación contra el cáncer[editar]

Tanto el CGH convencional (en metafase) como los nuevos arrays CGH se han utilizado principalmente para la identificación de regiones cromosómicas duplicadas o suprimidas en células tumorales, teniendo el aCGH importantes aplicaciones en el diagnóstico y estudio de la prognosis del cáncer.[4]

Durante el desarrollo de un tumor, ocurren numerosas alteraciones tanto genéticas como epigenéticas que contribuyen a su patogenicidad. Como se ha comentado con anterioridad, la información obtenida a partir de estos estudios de CGH sobre los distintos tipos de tumores muestran que muchos de ellos presentan patrones de alteraciones cromosómicas característicos, que además varían según la fase de desarrollo del tumor[6] Algunas de las alteraciones detectadas son comunes para todos los tipos de tumor, mientras que otras son específicas de cada uno de ellos. Por ejemplo, duplicación de ciertas regiones de los cromosomas 1q, 3q u 8q así como ciertas deleciones en los cromosomas 8p, 13q, 16q y 17p son comunes entre distintos tipos de cáncer como el de mama, ovarios, próstata, riñón o vejiga. Por otra parte, tenemos alteraciones específicas como determinadas ganancias cromosómicas en 12p y Xp en el cancer de testiculos o como ciertas ganancias en 13q y deleciones en 9q en el cáncer de vejiga.[1] El estudio de la presencia o no de cada una de las alteraciones características de un tipo de tumor que aparecen a lo largo de su desarrollo se espera que proporcione en el futuro un medio fiable de diagnosticar la fase en la que se encuentra el tumor, estableciendo de forma más precisa el riesgo de metástasis y el tratamiento a seguir por parte del paciente.

El método convencional se basa en la hibridación de DNA del tumor (marcado con un fluoróforo que en la mayoría de los casos es fluoresceína -FITC-) y DNA normal (generalmente marcado con rodamina o Texas Red) a un soporte con DNA en metafase y su uso ha sido importante para identificar algunas de estas alteraciones más importantes. Sin embargo, el uso de aCGH se está imponiendo en cuanto al diagnostico y monitorización de la progresión de un tumor.[7] [8]

Diagnóstico de enfermedades genéticas[editar]

Asimismo, las técnicas de CGH se utilizan en el diagnostico de diversas enfermedades genéticas, de mayor o menor complejidad, que suponen una ganancia o pérdida de material genético: detectandose aquellas alteraciones cromosómicas características de las mismas. El uso del aCGH ha posibilitado, además, la identificación de enfermedades causadas por micro-alteraciones como el caso de la delección que causa el síndrome de Prader-Willi.[9] Este tipo de elecciones y duplicaciones no eran detectables usando el cariotipo o el CGH convencionales debido a su reducido tamaño.[10]

Por último, mencionar el uso del CGH en el estudio de mutaciones anteriormente desconocidas relacionadas con retraso mental, autismo u otros trastornos en el desarrollo en niños.[11]

Diagnóstico prenatal y preimplantatorio[editar]

Finalmente, también se ha generalizado el uso de esta técnica en diagnósticos prenatales, para el estudio de la presencia de determinadas alteraciones cromosómicas en el genoma del feto y en el diagnóstico genético preimplantatorio, para la selección de embriones libres de dichas anormalidades. 

La aplicación del CGH en este campo, implica la previa amplificación del genoma proveniente de una única célula que será posteriormente estudiado. Aunque el cariotipo clásico es más barato, el CGH está desplazando a la citogenética clásica y al FISH debido a su rapidez, precisión, mayor resolución y por evitar el uso de cultivos celulares (y por tanto del fenómeno de mosaicismo en ellos). La mayoría de los métodos "tradicionales" de valoración de la viabilidad del embrión se basan en la evaluación morfológica del mismo en diferentes fases del desarrollo preimplantacional. No hace mucho se describió una cierta asociación entre la morfología del blastocisto y la presencia de ciertas aneuploidías, estableciéndose las bases del screening genético preimplantacional (PGS) para asesorar la viabilidad del mismo. Con la introducción del CGH en esta rutina clínica, no solo se facilita la selección de embriones sanos sin anomalías cromosómicas, sino que esta técnica permitirá mejorar la eficiencia de la fecundación in vitro aumentando la tasa de implantación de embriones y reduciendo el número de embarazos múltiples y abortos espontáneos. Además, el CGH array permitirá detectar el sexo del genoma analizado (feto) ya que permite distinguir el doble cromosoma X a través de un marcaje de XX sobre XY usando una muestra control de un individuo cuyo sexo es conocido.[12] [13] [14] [15]

Limitaciones[editar]

Las principales limitaciones de esta técnica provienen del hecho de que lo que se realiza es una comparación cuantitativa.

  • Las translocaciones equilibradas e inversiones, así como la formación de cromosomas en anillo, no se pueden detectar porque lo que se está comparando es cantidad de DNA, no si este se encuentra en un lugar del genoma al que no le corresponde.
  • Las translocaciones robertsonianas tampoco serán detectables ya que los brazos p implicados en este tipo de translocación no se encuentran representados en el CGH.
  • Esta técnica se limita a detectar aneuploidías, es decir, duplicaciones o deleciones de cromosomas o de partes de ellos. Pero es incapaz de detectar un juego completo de cromosomas de más o de menos (poliploidías) ya que al normalizar los resultados, los cambios globales de material genético se obvian.
  • No detecta mutaciones puntuales ya que la resolución no es tan amplia.
  • Para que una pérdida o ganancia de material genético sea detectada por CGH convencional, ésta debe ser al menos de 5 - 10 Mb de longitud.[16]
  • En el caso del aCGH, la resolución estándar se sitúa entre 1 y 5 Mb, aunque se ha conseguido superar esa barrera llegando hasta 40 Kb complementando el array con clones extra.[16]
  • Pueden obtenerse resultados anómalos en el caso de que la muestra provenga de un organismo mosaico.[17]

[17]

Referencias[editar]

  1. a b Forozan F, Karhu R, Kononen J, Kallioniemi A, Kallioniemi OP (1997) Genome screening by comparative genomic hybridization. Trends Genet 13:405-409.
  2. a b «Cytogenetic Methods and Disease: Flow Cytometry, CGH, and FISH.». Nature Education. 2008. http://www.nature.com/scitable/topicpage/cytogenetic-methods-and-disease-flow-cytometry-cgh-772. Consultado el 23 de diciembre de 2012. 
  3. a b Revisión de técnicas de citogenética convencional y molecular y su implicación en el diagnóstico y pronóstico del cáncer. http://www.cfnavarra.es/salud/anales/textos/vol24/suple1/suple3a.html. Consultado el 23 de diciembre de 2012. 
  4. a b Weiss MM, Kuipers EJ, Meuwissen SG, van Diest PJ, Meijer GA (2003) Comparative genomic hybridization as a supportive tool in diagnostic pathology. J Clin Pathol 56:522-527.
  5. «Aplicaciones del laboratorio de citogenética a la clínica». Consultado el 23 de diciembre de 2012.
  6. Forozan F, Karhu R, Kononen J, Kallioniemi A, Kallioniemi OP (1997) Genome screening by comparative genomic hybridization. Trends Genet 13:405-409.
  7. Marquis-Nicholson R, Aftimos S, Hayes I, George A, Love DR (2010) Array comparative genomic hybridization: a new tool in the diagnostic genetic armoury. NZ Med J 123:50-61.
  8. de Ravel TJ, Devriendt K, Fryns J-P, Vermeesch JR (2007) What’s new in karyotyping? The move towards array comparative genomic hybridization (CGH). European journal of pediatrics 166:637-643.
  9. L’Hermine AC, Aboura A, Brisset S, Cuisset L, Castaigne V, Labrune P, Frydman R, Tachdjian G. (2003) Fetal phenotype of Prader–Willi syndrome due to maternal disomy for chromosome 15. Prenat Diagn 23:938-943.
  10. Vissers LE, de Vries BB, Osoegawa K, Janssen IM, Feuth T, Choy CO, Straatman H, van der Vliet W, Huys EH, van Rijk A, Smeets D, van Ravenswaaij-Arts CM, Knoers NV, van der Burgt I, de Jong PJ, Brunner HG, Geurts van Kessel A, Schoenmakers EF, Veltman JA (2003) Array-based comparative genomic hybridization for the genome-wide detection of submicroscopic chromosomal abnormalities. Am J Hum Genet 73:1261-1270.
  11. Pawel Stankiewicz, Arthur L Beaudet, "Use of array CGH in the evaluation of dysmorphology, malformations, developmental delay, and idiopathic mental retardation, Current Opinion in Genetics & DevelopmentVolume 17, Issue 3June 2007Pages 182-192
  12. Evangelidou P, Alexandrou A, Moutafi M, Ioannides M, Antoniou P, Koumbaris G, Kallikas I, Velissariou V, Sismani C, Patsalis PC (2013) Implementation of High Resolution Whole Genome Array CGH in the Prenatal Clinical Setting: Advantages, Challenges, and Review of the Literature. BioMed Research International 2013.
  13. Fiorentino F (2012) Array comparative genomic hybridization: its role in preimplantation genetic diagnosis. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology 24:203-209.
  14. Lee CN, Lin SY, Lin CH, Shih JC, Lin TH, Su YN (2012) Clinical utility of array comparative genomic hybridization for prenatal diagnosis: a cohort study of 3171 pregnancies. BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology 119:614-625.
  15. Carmen Rubio, Lorena Rodrigo, Pere Mir, Emilia Mateu et al. "Use of array comparative genomic hybridization (array-CGH) for embryo assessment: clinical results", Fertility and SterilityVolume 99, Issue 415 March 2013Pages 1044-1048
  16. a b Oostlander AE, Meijer GA, Ylstra B (2004) Microarray-based comparative genomic hybridization and its applications in human genetics. Clin Genet 66:488-495.
  17. a b «Consenso para la Implementación de los Arrays [CGH y SNP-arrays en la Genética Clínica]». Consultado el 23 de diciembre de 2012.