Criofractura

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Introducción[editar]

Archivo:Me-nucleocriof1.png
riofractura de membrana nuclear (izquierda), dónde se pueden observar los poros nucleares. A la derecha se puede observar citoplasma y otros orgánulos membranosos del citoplasma celular.

La criofractura es una técnica utilizada en microscopia electrónica, consistente en la congelación de muestras biológicas con nitrógeno líquido (-195,8°C), seguido de un corte o fractura y el sombreado metálico o recubrimiento con carbono de la superficie de la muestra. Luego procediendo a la eliminación del tejido biológico subyacente al sombreado y la observación de esta réplica de la muestra mediante el uso de un microscopio electrónico de transmisión[1] [2]

Historia[editar]

La técnica de la criofractura fue desarrollada de manera temprana en la década de 1950 por el científico Russell Steere,[3] sin embargo no fue hasta 1960, cuando Daniel Branton[4] comienza investigar mediante criofractura y a exhibir las imágenes obtenidas, demostrando que poseían la claridad necesaria para convencer al mundo científico de su utilidad en la investigación. Esta técnica llegó a su auge como fuente de investigación celular en las décadas del 70 y 80, al proporcionar avances en la comprensión de la organización estructural de membranas y organelos imposibles de identificar mediante el uso de otras técnicas existentes.[5]

Técnica[editar]

Microscopio electrónico de transmisión. Herramienta utilizada en la visualización de muestras obtenidas mediante criofractura.

Existen 4 pasos esenciales para la realización de una replica por criofractura:[6]

  • 1. Congelación rápida de la muestra:

Esto se logra sumergiendo rápidamente la muestra (previamente tratada con un crioprotector como el glicerol para evitar la formación de cristales de hielo en el interior de la muestra) en nitrógeno líquido, a una temperatura cercana a los -195,8 °C.

  • 2. Fractura de la Muestra

Se lleva a cabo en condiciones de vacío, bajo una cuchilla de diamante o romperla en una dispositivo de bisagra. También existe la variante simple de la técnica, en que la facturación se efectúa en una atmósfera de nitrógeno liquido, a una presión de 3 ATM con el uso de una cuchilla de afeitar.

  • 3. Fijación de platino - carbono

Se procede a evaporar una fina capa de carbono - platino sobre la muestra. Así, las características topográficas de la superficie congelada se convierten en variaciones en el espesor de la capa de platino depositada sobre la muestra.

  • 4. Limpieza de la réplica

Posteriormente a la fijación, la muestra se lleva a presión atmosférica y se le deja calentar a temperatura ambiente. El material biológico restante en la replica es eliminado mediante el empleo de una solución de ácido crómico, hipoclorito de sodio u otros agentes limpiadores.

Referencias[editar]

  1. http://www.medicoscubanos.com/diccionario_medico.aspx?q=criofractura
  2. http://encina.pntic.mec.es/~esarment/web%20maluque/imagenes/Visita%20al%20CBM.pdf
  3. Steere, R.L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J. Biophys. Biochem. Cytol. 3, 45–60 (1957).
  4. Branton, D. 1966. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:1048–1056.
  5. Wehrli, E., Mühlethaler, K. & Moor, H. Membrane structure as seen with a double replica method for freeze-fracturing. Exp. Cell Res. 59, 336–339 (1970).
  6. http://www.nature.com/nprot/journal/v2/n3/full/nprot.2007.55.html

Véase también[editar]